Способ получения фибринолитического фермента

Способ получения фибринолитического фермента

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Союз Советски к

Соцналнстнчесинк

Республик

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТИЛЬСТВУ (61) Дополнительное к авт. свид-ву— (22)Заявлено24.06.80 (21) 2945300/28-13 с присоединением заявки М (23) Приоритет

Опубликовано 23.02 82 Бюллетень,1ее 7

Дата опубликования описания 23.02. 82. (5! )М. Кл.

С 12 N 9/50

Коеударствеииый комитет

СССР по делам изебретеиий и аткрытий (53) УДК577. 15 (088.8) (72) Авторы изобретения

Н,Н.Фалина, Н.П.Денисова, Н.Н.Петрищев и Н.В.Псурцева (71) Заявитель

Ботанический институт им. В.Л. Комарова (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ

Изобретение относится к проиэвод= ству ферментов, в частности к получению фибринолитических ферментов, которые могут быть использованы в медицине.S

Известен способ получения фибрннолитического фермента из базидиального гриба Armi11аrià meliea, заключающийся в обработке плодовых тел грибов водой при 2 С и извлече,о, нии водного экстракта вещества, содержащего фермент. После этого при рН 6,0 дважды этиловым спиртом или другим органическим растворителем, смешнвающимся с водой, осаждают при минус 5 С AN-протеазу. Очистку протеаэы ведут ионообменной хроматографией и гельфильтрацией. Полученный фермент лиофилиэуют. Способ позволяет получить фермент, обладающий способностью к разрушению фибрина и вызывающий антикоагулирующее действие 11).

3

ФИБРИНОЛИТИЧЕСКОГО ФЕРМЕНТА ! ! !

2Однако ограниченность ассортимента исходного сырья и трудоемкость извлечения из него фермента, а также отсутствие отечественных фибринолитических препаратов иэ базидиальных грибов заставляет предпринимать поиски новых путей получения фибринолитического фермента иэ других родов съедобных грибов.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому положительному эффекту к предлагаемому является способ получения фибринолитического фермента из плодовых тел базидиального гриба Tricholoma Е1аvovirens (Fr) Lundell et Nannp синоним Т. eguestre (зеленушка).

Способ получения фибринолитического фермента заключается s том, что собранные грибы предварительно высушивают, затем плодовые тела размельчают и суспензируют в физиологическом растворе при соотношении грибы: раствор, равном 1:10, 907070. 40

55 водопроводной воды в течение трех суток (отсутствие ионов 0 проверяпосле чего проводят экстрагирование белков (инкубацию суспензии) при 37 С ь течение 2-3 ч, затем в течение ночи при комнатной температуре. Далее отделяют экстракт фильтрацией через марлю и повторно через фильтр Шамберлена, .после чего выделяют фермент в верхний слой центрифугированием, предварительно осветлив раствор добавлением 20Х-ного уксусного цинка при соотношении 1:10, для того, чтобы удалить балластные пигментные вещества. Выделенный фермент диализуют против дистиллированной воды в течение нескольких дней и лиофилизуют 12).

Однако известный способ не позволяет получить достаточно высокую активность фибринолитического фермента из Тгicholoma flavovirens, так как на стадии экстракции при 37 С происходит частичная потеря биологической активности фермента и не предусматривается концентрация белков, содержащих фермент.

Кроме того, известный способ длителен за счет стадии высушивания грибов и обработки больших объемов растворов (1:1О), а также их двойной фильтрации через марлю и фильтр

Шамберлена, что к тому же явл1яется трудоемкой операцией.

Цель изобретения — повышение активности фермента, обладающего фибринолитическим действием.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения фибринолитического фермента из плодовых тел баэидиального гриба рода

Tricholoma путем суспендирования плодовых тел, экстрагирования белков из суспензии, отделения экстракта и выделения из него фермента с последующим диализом и лиофилизацией целевого продукта, используют плодовые тела Tricholoma portentosum (Fr) Quel экстрагирование .о осуществляют при 3-5 С в течение

l2-14 ч, а выделение фермента проводят сернокислым аммонием до насыщения 0,75-0,80 в течение 1-2 ч.

Проведение экстрагирования на холоду при 3- > С1юзволяет сохранить фермейт в нативиом состоянии. В течение 12-14 ч происходит полное экстрагирование фермента. Выделение фермента из экстракта сернокислым

35 аммонием позволяет сконцентрировать в осадке белки, содержащие фермент.

При насыщении сериокислым аммонием от 0,75 до 0,80 осаждаются белки с фибринолитической активностью, тогда как при насыщении ниже 0,75 наблюдается потеря фермента, а выше

0,8 в осадок выпадают неактивные балластные белки, что загрязняет продукт и снижает его удельную активность. Шадящий режим осаждения в течение 1-2 ч, за которые полностью формируется осадок, способствует сохранению исходной активности нативного фермента, тогда как более длительная экспозиция осадка приводит к частичной необратимой денатурации белка, который теряет свою биологическую активность.

Способ осуществляется следующим образом.

Свежие плодовые тела Tricholoma

portentosum суспензируют в физиологическом или забуференном физиологическом растворе (рН 7,0-7,2) при соотношении грибы: раствор, равном

1:38 после чего экстрагируют при

3-5 С в течение 12-14 ч, затем центрифугируют и супернатант осаждают сернокислым аммонием до насыщения

0,75-0,80, концентрируя фермент в осадке. Через 1-2 ч осадок отфильтровывают, .растворяют в дистиллированной воде и диализуют в течение 2-3 дней сначала против водопроводной. воды, затем против дистило лированной при 4 С и далее лиофильно высушивают.

EI p и м е р. К 1 кг очищенных плодовых тел грибов Т. portentosum, собранных в Минской области, добавляли физиологический раствор (pH 7,2) в соотношении 1:3 и грибы размельчали в гомогенизаторе (РТ-2). Полученный гомогенизат оставляли на 14 ч, .о при 5 С для зкстракции фермента, после чего экстракт центрифугирова:ли (3,5 тыс. об/мин), осадок отбрасывали, а из экстракта высаливали фермент сернокислым аммонием до насыщения 0,8 ч в течение одного часа при 4 С. 8атем осадок отфильтровывао ли на бумажном фильтре и собирали.

Полученный ферментативный белок растворяли в 40 мл дистиллированной воды и ставили на диализ против проточной

90?070 6

Тромболитическая активность состав1 ляет 2,0 ч на 1 мг белка.

Для сравнения активности фермента, полученного по предлагаемому способу, с активностью фермента, полученного по известному была.произведена оценка фибринолитической (ФА) и фибриногенолитической (Ф1 А) актив-!

О ности по методу, описанному Эстоло и другими.

Фермент, полученный по предлагаемому способу

1:64

1:1924

Фермент, полученный по известному способу.1: 16

1:128

Зо

Из таблицы видно, что предлагаемый способ получения фибринолитического фермента из базидиального гриба Т. роrtentosum позволяет в 4 раза повысить фибринолитическую активность фермента, а фибриногенолитическую активность в 8 раз по сравнению с известным.

Кроме того, получаемый по предлагаемому способу фермент, как видно

Hs примера обладает, тромболитическим 4О действием, что является особенно важным, учитывая отсутствие отечественных тромболитических препаратов не микробного происхождения.

Высокая фибринолитическая активность полученного предлагаемым способом фермента была подтверждена в экспериментах с плазмой крови ла" бораторных животных и в опытах in vivo.5О

ВНИИПИ Заказ 519/34 Тираж 505 Подписное

Филиал ППП "Патент" > г. Ужгород, ул. Проектная, 4

5 ли качественной реакцией с ВаС1 ).

Затем раствор фермента диализовали против дистиллированной воды в .течение 14 ч при 4 С. Отдиализованиый раствор фермента лиофильно высушивали. Получили 1,5 г сухого фермента со специфической фибринолитической активностью.

Удельная фибринолитическая активность фермента (по Аструпу) сос" тавляет 16850 ед., фибринолитическая активность (по Эстоло) — 1:.64, фибриногенолитическая (по Эстоло)

1:1024.

Таким образом, предложенное изобретение позволяет повысить активность фибринолитического фермента.

Результаты сравнения приведены в таблице..

Формула изобретения

Способ получения фибринолитического фермента иэ плодовых тел баэидиального гриба рода Tricholoma путем суспендирования плодовых тел, экстрагирования белков из суспензии, отделения экстракта и выделения из него фермента с последующим àливом и лиофилизацией целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью повьппения активности фермента, используют плодовые тела Tricholoma portentosum.(Fr) Цие1 экстрагирование осуществляют при

3-5 С в течение 12-14 ч, а выделение фермента проводят сернокислым аммонием до насыщения 0,75-0,80 в течение 1-2 ч.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Патент Франции Р 2070093, кл. С 07 Х 7/ОО, 1971.

2. Estola et- al uAnnales medicinae experimentalis et В1о1оп1ае

Fenniae", 1955, v. 33, 11 4, р. 384-391.