Способ получения рибофлавина

Способ получения рибофлавина

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РИБОФЛАВИНА путем глубинного культивирования продуцирующих его микроорганизмов вида Bacillus subtilis в условиях аэрации на.питательной среде. содержащей источник углерода, азота, необходимые минеральные соли в присутствии источников ростовых веществ , отличающийся тем, что, с целью повышения выхода рибофлавина , в качестве продуцирующих рибофлавин микроорганизмов из вида Bacillus;subtilis используют штамм Bacillus subtilis ВНИИгенетика-304 или ВНИИгенетика-304а 2, Способ ПОП.1, отличающийся тем, что культивирование ведут на питательной среде, содержащей в качестве источника углерода сахар-сырец или мелассу, а в качестве источников ростовых факторов используют белково-витаминный концентрат или его гидролизат или автолизат,или пищевые дрожжи, или дрожжевой экстракт.

„„SU„„,908092

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН за3) С 12 P 25/00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 2981423/28-13 (22) 04.09.80 (46) 30.12.84. Бюл. N 48 (72) А.Я. Куканова, В.Г. Жданов, А.И. Степанов и В.А. Панова (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов (53) 577.16 (088.8) (56) 1. Авторское свидетельство СССР

Р 389132, кл. С 12 D 5/04, 1969.

2. Патент США У 3900368, кл. 195-96, опублик. 1976. (54)(57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РИБОФЛАВИНА путем глубинного культивирования продуцирующих его микроорганизмов вида BaciIIus subtiIis в условиях аэрации на.питательной среде, содержащей источник углерода, азота, необходимые минеральные соли в присутствии источников ростовых веществ, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода рибофлавина, в качестве продуцирующих рибофлавин микроорганизмов из вида

Bacillus subtiIis используют штамм

BaciIIus subtiIis ВНИИгенетика-304 или ВНИИгенетика-304а.

2. Способ по п.1, о т л и ч а юшийся тем, что культивирование ведут на питательной среде, содержащей в качестве источника углерода сахар-сырец или мелассу, а в качестве источников ростовых факторов используют белково-витаминный.концентрат или его гидролизат или автолизат,или пищевые дрожжи, или дрожжевой экстракт.

1 908

Изобретение относится к микробио. логической промышленности, а именно к способу получения рибофлавина (В ).

Витамин Вг широко используется в

5 сельском хозяйстве, в основном в качестве кормовых добавок сельскохозяйственным животным, а кристаллический рибофлавин применяется в пищевой и фармацевтической промышленности.

Рибофлавин получают химическим способом, а также путем микробиологического синтеза.

Известен способ микробиологического производства рибофлавина путем использования культуры гриба Eremothecium ashbyii на соевой ферментационной среде, содержащей гидрол и кукурузный экстракт и . За 96 ч процесса ферментации накапливается до 2000 мг/л В . К недостаткам такого способа следует отнести длительный период роста культуры, вследствие чего увеличивается продолжительность .ферментации,и повышенную чувствитель- ность к загрязнению посторонней микрофлорой.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому эффекту является способ получения рибофлави30 на-витамина В путем культивирования г его продуцентов-микроорганизмов вида BaciIIus subtiIis на питательной среде, содержащей 8 глюкозы в качестве источника углерода, минеральные соли и источники ростовых вещестьЗ5 дрожжевой экстракт, пептон, глутами- новую кислоту, препараты РНК, пурины и аналоги пуринов (2 ). За 44 ч процесса ферментации накапливалось до

560 мг/л рибофлавина.

Недостатками способа является сравнительно низкий уровень активности, достигаемый культурой BaciIIus .subtiIis и необходимость в дорогостоящих и дефицитных компонентах ферментационной и ростовой сред.

Целью изобретения является повышение выхоДа рибофлавина.

Поставленная цель достигается тем, что в способе получения рибофла-5О вина, предусматривающем глубинное культивирование продуцирующих его .микроорганизмов вида BaciIIus subtiIis в условиях аэрации на питательной среде, содержащей источник угле- SS рода, азота, необходимые минеральные соли в присутствии источников ростовых веществ, в качестве продуци092 2 рующих рибофлавин микроорганизмов .из вида BaciIIus subtiIis используют штамм BacbiIIus subtiIis ВНИИгенетика-304 или ВНИИгенетика-304а.

При этом культивирование ведут на питательной среде, содержащей в качестве источника углерода сахар-сырец или мелассу, а в качестве источников ростовых факторов используют белково-витаминный концентрат или его гидролизат или автолизат, или пищевые дрожжи, или дрожжевой экстракт.

Используемые штаммы-сверхсинтетики сконструированы генетическими методами из независимо полученных мутаций, каждая из которых приводит к сверхсинтезу витамина:

ros — ribc — AGR (устойчивость к и розеофлавину ros мутация в генерегуляторе ribs, устойчивость к

8-азагуанину AGH). Затем проводилась мутагенная обработка нитрозогуанидином, нитрозометилмочеви " ной, облучение ультрафиолетом и селекция активных вариантов на ферментационной среде °

Штамм ВНИИгенетика-304-прототроф, штамм ВНИИгенетика-304а — ауксотроф с неидентифицированной ростовой потребностью. Оба штамма олигоспорогенные, на всех средах количество спор по сравнению с исходным штаммом снижено на 3-4 порядка.

Способ осуществляют следующим образом.

Культуру ВНИИгенетика-304 или

ВНИИгенетика-304а выращивают на агаризованной среде Хоттингера или мясо-пептонном агаре (МПА) в течение

1-2 суток при температуре 28-37 С.

Затем суспензию клеток передают в колбы с посевной средой, содержащей мелассу, БВК и минеральные соли, либо в картофельную посевную среду, либо МПБ. Посевной материал выращивают в течение 17-24 ч на качалке

200 об/мин, Затем посевной материал передают в количестве 5-103 в основную ферментационную среду. Процесс ферментации осуществляют в колбах

Эрленмейера на качалке, либо в ферментере при интенсивном перемешивании и аэрации в течение 46-50 ч нри температуре 37 С, рН 6,5-7,5 (в начале ферментации) на питательной среде, содержащей источники углерода, например глюкозу, сахаро9080

3 зу, сахар-сырец, мелассу, крахмал источники минерального азота, например соли аммония, мочевнны нитраты; соли фосфора, например, фосфата калия, аммония и другие соли; соли

Mn (MnCI, MnS0 ), а также источ5 ники ростовых факторов, например, биомассу кормового дрожжевого белка (БВК), гидролизаты и автолизаты БВК, пищевые дрожжи, дрожжевой экстракт, кукурузную и соевую муку, кукурузный экстракт., гидролизат казеина, пептон. Через 46-50 часов ферментации в культуральной жидкости накапливается 700-1000 мг/л рибофлавина.

Пример 1. Односуточную культуру ВасiIIus subtЖз ВНИИгенетика-304, выращенную на косяках MIIA пересеивают на жидкую посевную среду, содержащую 6% мелассы, 1% БВК и, 20 минеральные соли, Посевная среда готовится разведением пополам стерильной водой ферментационной среды, состав которой приведен ниже. Выращивание посевного материала проводят в колбах Эрленмейера, объемом

750 мл (объем среды 25-100 мп), на качалке 200 об/мин при 37 С в течение 17 часов и передают в количестве 10% в ферментационную среду следующего состава, %:

Меласса 12

БВК 2 (ИН )2 ЯО 0,2

K III 0 1,4

КН РО 0,6 Ç5

М БО 0,01

Na С Н,О, (цитрат Na) 0,1 РН

7,0-7,2.

Ферментацию осуществляют в колбах Эрленмейера, объемом 750 мл 40 (объем среды 25 мл) на качалке

20) об/мин при 37 С. Через 48 ч ферментации культуральная жидкость содержит 700- 1000 мг/л рибофлавина.

Пример 2. Аналогичен приме- 45 ру 1, только используют штамм

BaciIfus subtiIis-304a.

Пример 3. В качестве продуцента также используют штаммы

ВНИИгенетика/304. Ферментационная среда и условия ферментации, как указано в примере 1. Отличием является состав посевной среды, которая готовится следующим образом. Картофель очищают от кожуры, режут на 5 куски и заливают небольшим количест- вом воды, после чего стерилизуют при 0,8-1 атм. Посевную среду за92 4. севают с косяков MTIA культура растет в колбах на 750 мл (объем среды 50-100 мл) на качалке при

37 С в течение 24 ч. Ферментацион-о ную среду засевают 10% посевного ,материала, ферментацию проводят, как в примере 1.

Через 48 ч ферментации культуральная жидкость содержит 700-1000 мг/л рибофлавина.

Пример 4. Так же как в примере 3, только используют штамм

BaciIIus subtiIis-304a.

Пример 5. Культура, посевная среда, условия ферментации, как в примерах 1,2 и 3. Отличием является состав ферментационной среды,%:

Сахароза (или сахар-сырец) 12-14

БВК 3-4

Минеральные соли, как в примере 1.

Через 48 ч ферментации культуральная жидкость содержит 7001000 мг/л рибофлавина.

Пример 6. Односуточную культуру штамма ВНИИгенетика-304 с косяков MIIA переносят в посевную среду МПБ, на которой 8-10 ч на качалке при 37ОС готовится-посевной материал. В количестве 10% посевной материал переносится в ферментационную среду, имеющую состав,%:

Глюкоза 8

Дрожжевой экстракт 0 5

Гидролиэат казеина или пептон 0,02

Минеральные соли как в примере 1. рН 7, 1-7,2. Ферментация длится

44-50 ч при 37 С в колбах на качалке 200 об/мин. Через 48 ч ферментации культуральная жидкость содержит 700-1000 мг/л рибофлавина.

Максимальный выход рибофлавина в предлагаемом способе составляет

1000 мг/л за 48 ч роста культуры на синтетических или крмплексных средах, что на 40% превосходит активность штаммов-пр8дуцентов в прототипе. Кроме того, в отличие от указанного прототипа, используют более простые среды, не содержащие дорогостоящих компонентов. .Получение рибофлавина предлагаемым способом обладает рядом преимуществ по сравнению с пействую908092

Культурально-морфологическая характеристика штаммов-продуцентов рибофлавина Вас. subtiIis ВНИИгенетика-304 и ВНИИгенетика-304а.

Штамм ВНИИгенетика-304

Морфология под микроскопом

Морфология на разных средах.

Мясо-пептонный агар (МПА) Спорообразующая граммположительйая палочка длиной 2-3р.

На 1-2 сутки роста при 28-37 С образует колонии с неровным краем, звездчатые,диаметром 3-4 мм, поверхность гладкая, блестящая, цвет желтоватый. Рост rro уколу умеренный, в основном на поверхности среды:

Мясо-пептонный бульон (МПБ) Рост без качания на поверхности бульона в виде пленки.

На 2 сутки роста образует колонии диаметром 2-3 мм, ярко-желтого цвета, флоурисцируют в УФ-лучах желтым цветом, колонии круглые с гладким краем., блестящие

Минимальнж среда

Спицайзена с глюкозой

Не растет на минимальной среде

Растет при 20-42 С, оптимум 3? С рН 5,0-9,0, оптимум 7,0-8,0.

Углеводы: хорошо утилизируют глюкозу, сахарозу, крахмал.

Спирты: утилизируют этанол, сорбитол

Источники азота: хорошо усваивает аммоний, мочевину, нитраты.

Желатину разжижает.

Физиологические свойства

Техред С.Мигунова Корректор А. Ильин

Редактор С. Титова

Заказ 9246/4

Тираж 521 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул. Проектная,4 щими в настоящее время произволством рибофлавина с помощью аскомицета Eremotheaum ushbyii (базовьи способом). Помимо уже упоминавшейся меньшей требовательности к составу питательных сред в предлагаемом способе почти вдвое сокращается время ферментации (48 ч вместо 72-9б ч), а также уменьшается возможность загрязнения культуры посторонней микрофлорой.

По сравнению с прототипом пред5 лагаемый способ характеризуется более высоким уровнем выхода продукта и возможностью использовать простые и доступные по составу среды-.