Ингибитор,обладающий противовирусной активностью,и способ его получения

Ингибитор,обладающий противовирусной активностью,и способ его получения

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

1. Ингибитор, обладающий противовирусной активностью, имеет элементарный состав,%: С 13,38 t Н 2,24 ± 0,2 N 28,90 i 0,2 S, 1,20 i 0,2 Р 5,78 ±0,2 О - Остальное Молекулярный вес 190000 Дальтон. Максимум поглощения в УФ-спекхре 274 нм. Прозрачная светло-розовая жидкость , хорошо растворима в воде, ростовых питательных средах, термостабильна , после лиофилизации - светлорозовый порошок. Блокирует развитие цитодеструктивных изменений в инфицированных вирусакм клетках и подавляет накопление инфекционных вирусных частиц , чувствителен к трипсину, обладает рибонуклеазной активностью, рохраняет ее после обработки антителами к рибонуклеазе, но теряет при этом вирусингибируюцие свойства, вирусингибирующее действие не связано с HapsmieHHeM биосинтетических клеточных процессов или синтезом интерферрна, подавляет репродукцию как РНК-, так и ДНК-содержащих вирусов , сохраняет вирусингибируюцие действия после лиофилизации, обладает гемагглютинирующей активностью. 2. Способ получения ингибитора, обладающего противовирусной актив (Л ностью, включающий инкубацию вируса с р рибонуклеазой, центрифугирование и отделение конечного продукта - супернатанта , отличающийся а тем, что, с целью повышения выхода ъ О СО 00 ингибитора и его эффективности, инкубируют , например, венесуэльского энцефиломиелита лошадей (ВЭЛ ) с панкреатической рибонуклеазой при в течение 20-60 мин, после чего центрифугируют до образования плотного осадка, выдерживают на холо.де при 3-5 С в течение 24-72 ч и здтем отделяют конечный продукт - су ,1;ернатант.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

РЕСПУБЛИК (1В (1l) 3 5В А 61 К 45 02

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

= I

К ASTOPCHOMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 2932460/30-15 (22) 15.04.80 (46) 07.06.83. Бюл..Р 21 (72) В.И. Вотяков, М.E. Хмара и В.М.. Ткач. (71) Белорусский ордена Трудового

Красного Знамени научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии ,(53) 615.371(088.8) (56) 1. Соловьев В.Д., Бетемиров Т.А., Интерферон в теории и практике медицины. М., 1970, с. 52-100. (54) ИНГИБИТОР, ОБЛАДАЮЩИЙ ПРОТИВОВИРУСНОЙ АКТИВНОСТЬЮ, И СПОСОБ ЕГО

ПОЛУЧЕНИЯМИ (57) 1. Ингибитор, обладающий протйвовирусной активностью, имеет элементарный состав,Ъ

С 13,38 Й 0,2

Н 2,24 + 0,2

Й 28,90 «+ 0,2

S, 1,20 + 0,2

Р 5,78 0,2., О - Остальное

Молекулярный вес 190000 Дальтой.

Максимум поглощения в УФ-спектре i

274 нм.

Прозрачная светло-розовая жидкость, хорошо растворима в воде, ростовых питательных средах, термостабильна, после лиофилизации - свет лорозовый порошок .

Блокирует развитие цитодеструктивных изменений в инфицированных вирусами клетках и подавляет накопление инфекционных вирусных частиц, чувствителен к трипсину, обладает рибонуклеазной активностью, сохраняет ее после обработки антителами к рибонуклеазе, но теряет при этом вирусингибирующие свойства .. вирусингибирующее действие не связано с. нарушением биосинтетическнх клеточных процессов или синтезом интерферона, подавляет репродукцию как РНК-, так и ДНК-содержащих вирусов, сохраняет вирусиигибирунхцие дей-ствия после лиофилизации, обладает гемагглютинирующей активностью. ф

2..Способ получения ингибитора, обладающего противовирусной активностью, включающий инкубацию вируса с рибонуклеазой, центрифугирование и отделение конечного продукта - супернатанта, о т л и чающий с я тем, что, с целью повыаения выхода ингибитора и его эффЕктивности, инкубируют, например, витаус венесуэльского энцефиломиелита лошадей (ВЭЛ ) с панкреатической рибонуклеазой при

56-95 С в течение 20-60 мин, после чего центрифугируют до образования плотного осадка, выдерживают на холо; де при 3-5 С в течение 24-72 ч и за" тем отделяют конечный продукт - супернатант.

909814

Изобретение относится к области биологической химии и вирусологии, а именно к получению макромолекулярных биологически активных. веществ, так как известно, что последние могут активно проникать в клетку и 5 оказывать влияние на синтез инфекционных вирусных-частиц.. Наиболее близким к предлагаемому веществу по своим свойствам является интерферон, который подавляет размно-)p жение разнообразных. вирусов в тканевых культурах, чувствителен к протеолитическим ферментам, термостабилен (56 — 80 С J, обладает рибонуклеаз.ной активностью; молекулярная масса, индуцированная вирусами в культу-., .ре ткани или аминотической жидкости находится в пределах 25000-160000 (1).

Однако интерферон обладает рядом недостатков, которые связаны cD сложностью его получения, способ- 20 ностью подавлять репродукцию вируса лишь при невысокой множественности инфицирования и наличием профилактического, опосредованного через клетку действия на вирус. 25 Целью изобретения является повышение выхода ингибитора и его эффективности, получение ингибитора с высокой вирусингибирующей активностью, обладающего прямым действием как 3р на PHK-, так и на ДНК - содержащие вирусы.

Ингибитор, обладающий противови-, рисной активностью, имеет элементный, состав,Ъ: 35

С 13, 38 4 0 2

Н.224+02

N 28,90 + 0,2

$, 1,20 + 0,2 .P 5,78+ 0,2

О Остальное 40

Молекулярный вес 190000 Дальтон.

Максимум поглощения в УФ-спектре

274 нм.

Прозрачная светло-розовая жид- 45 кость, хорошо растворима в воде, ростовых питательных средах, термостабкльна, при лиофилизации — светло-розовый порошок.

Блокирует развитие цитодеструк- 5О тивных изменений в инфицированных вирусами клетках и подавляет,на.копление инфекционных вирусных частиц; чувствителен к трипсину; обладает рибонуклеазной активноотью, сохраняеТ ее после обработки антителами к рибонуклеазе, но теряет при этбм,вирусингибирующие свойства; вирусингибирующее действие не .связано с нарушением биосинтетичес- ких кпеточных процессов или синтезом 60 интерферона, подавляет репродукцию как РНК-, так и .ДНК-содержащих ви. русовj,.сохраняет вирусингибирующие действия после лиофилизации, обладает гемагглютинирующей активностью.

Для получе ния ин ги бит ора, обло дающего противовирусной активностью инкубируют вирус с рибонуклеазой, центрифугируют и отделяют конечный

;продукт — супернатант, причем ингибитор, обладающий противовирусной активностью, получают путем совмеетного инкубирования клеточной вируСсодержащей суспензии, например вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей (ВЭЛ ), и панкреатической рибонуклеазы при температуре 56-95 С в течение 20-60 мин, после чего центрифугируют до образования плотного осадка, выдерживают на холоду при температуре 3-5 С в течение

24-72 ч и затем отделяют конечный продукт — супернатант, обладающий противовирусной активностью и рибо-. нуклеазной активностью.

Инкубирование клеточной вируссодержащей суспензии с рибонуклеазой при температуре 56-95 С в течение ,20-60 мин обеспечивает полную инактцвацию инфекционных свойств вируса и изменение физико-химических свойств .суспензии, в частности появление агрегатов, которые затем центрифугированием переводятся в осадок выдержит вание на холоде повышает вирусингибирующую активность супернатанта.

Пример 1. Для накопления, например, вируса ВЭЛ использовались первично трипсинизированные фиброобласти эмбриона кур (ФЭК ), которые готовились по общепринятой методике. Через 48 ч после засева клеток и образования сплошного монослоя производилась смена среды культивирования на поддерживающую, в качестве которой использована среда 199 с исключением сыворотки, и культура инфицировалась вирусом ВЭЛ из расчета 0,1 ТПД50 на клетку. Через 24 ч

:после появления вирусспецифической цитодеструкции монослоя культура

ФЭК шестикратнь эамораживалась и размораживаяуась с целью разрушения клеток. Затем производилось центрифугирование культуры для осаждения разрушенных клеток (3000 об/мин, 10 мин )и получался вируссодержащий супернатаит, который использовался для инкубирования с рибонуклеазой.

При применении, например, панкреатической рибонуклеазы Ленинградского завода мед. препаратов, последняя использовалась в концентрации

1,750 мкг на 1 мл полученного.супернатанта (один флакон официального препарата. панкреатической рибонуклеазы, содержащий 25 мг фермента, разводился, например, в 14 мл супер натанта вируссодержащей суспензии

ВЭЛ; исходное значение рН 6,8 ). Пос ле этого вируссодержащая суспензия

H рибонуклеаза инкубировались .сово местно при 92 С в течение 20 мин, осаждались появившиеся в процессе, 909814

1О инкубации агрегаты путем центрифугирования при 3000 об/мин в течение

10 мин, и суспензия выдерживалась при 4 С s течение 48 ч. Затем отделялся конечный продукт - супернатант, который обладал антивирусной актив- 5 ностью в объеме 0,2 мл на 1 мп 48-часовой культуры клеток ФЭК и который имел после лиофилизации следующий элементарный состав,Ъ:

С., 13,38 0,2

Н. 2,24 + 0,2

Х . 28,90 + 0,2

S 1у20 + 0,2

P 5,78 + 0,2

О Остальное

Молекулярная масса — 190000 Дальтон.

Максимум поглощения в УФ-спектре

274 нм. Полученный ингибитор обладал рибонуклеаэной активностью (см. табл. 1 ), а также гемагглютинирующей активностью (см. табл. 2 ).

Иакромолекулярная природа ингибитора иллюстрируется, помимо молекулярной массы и максимума поглощения в УФ-спектре, характерного для 25 белка (274 нм), следующими данными.

Полученный продукт был чувствителен к трипсину, который инактивировал его активирусное действие (см. табл. 3 }. Инактивация антивирусного 3О действия наблюдалась и в случае действия на ингибитор антисыворотки против рибонуклеазы (см. табл.4 ).

Макромолекулярная природа ингибитора подтверждалась также и высоким содер-35 жанием И и Р, что не исключает присутствия в нем олигонуклеотидов вирусного и клеточного происхожде-. ния.

П р и .м е р 2. Вируссодержащий супернатант, полученный, как указано в примере 1, инкубировался с рибонулеаэой при 95ОC в течение 60 мин и после осаждения образовавшихся агрегатов выдерживался при 5 С в течение 72 ч. Затем, как в примере 1, 45 отделялся конечный продукт — супер, натант, обладающий тЕми же свойствами, что и в примере 1, но меньшей антивирусной активностью по сравнению с примером 1. 50

Пример 3. Вируссодержащий супернатант, полученный, как указано в примере 1, инкубировался с рибонуклеазой при 56 С в течение

20 мин и после осаждения образовавшихся агрегатов выдерживался при 3 С

s течение 24 ч. Затем, как и в примере 1, отделялся конечный продукт,супернатант, который обладал теми

joe свойствами, что в примерах 1 и 2, .но меньшей антивирусной активностью.

С целью изучения вирусингибирующего действия макромолекулярного ингибитора, полученного по предложенному способу, исследовалось влияние супернатантов из неинфицированных 65 клеток, при готовленных с использованиемм рибонуклеазы по предлагаемому способу, на действие термической обработанной и необработанной (нативной ) рибонуклеаз в дозе 350 мкг и 1000 мкг на 1 мл инфицируемой вирусом ВЭЛ культуры ФЗК (т.е. в тех же дозах в пересчете на 1 мя, в каких рибонуклеаэа могла присутствовать в макромолекулярном ингибиторе, будучи добавленной при его получении, и трехкратно больших ), а также действие вирусосодержащих суспензий, полученных по предлагаемому способу, но беэ инкубации с рибонуклеазой.

Кроме того, действие макромолекулярного ингибитора вирусной активности сравнивалось с интерфероном, полученным иэ клеток ФЭК при помощи вируса болезни Ньюкасла, так как примеси интерферона могли быть в препарате, получаемом из инфицированных вирусом клеток, и который заведомо в больших количествах,как и все исследуемые ингредиенты, вносился одновременно с инфицированием культуры вирусом ВЭЛ.

Как видно из данных, представлен ных в табл. 5, внрусингибирующее действие, проявляющееся как в защите монослоя (блокирование цитопатогенного действия вируса ), так и подавлении репликации вируса, оказывают только макромолекулярные ингибиторы, полученные по предлагаемому способу, причем антивирусное действие не было связано с их прямой рибонуклеаз ной активностью.

Защитное действие макромолекулярного ингибитора вирусной активности, проявляющееся в блокировании цитодеструктивных изменений в монослое, вызываемых вирусом ВЭЛ, и подавлении его накопления в культуре клеток

ФЭК, не связано с синтезом интерферона, так как последний в культуре клеток ФЭК отсутствовал (см: табл. б ).

Гидролитическое действие макромолекулярного ингибитора в отношении

PHK не снималось актисывороткой, хотя, как указывалось выше, сыворотка против рибонуклеазы блокировала его антивирусное действие.

Ингибитор, полученный по способу, описанному в примере 1 (c вирусом

ВЭЛ ), обладал антивирусной актив" костью и в отношении. других PHK- u

ДНК-содержащих вирусов. Дествие ингибитора в отношении вирусов с фрагментированным геномом наблюдалось лишь при трехкратном увеличении дозы по сравнению с вирусами с нефрагментированным геномом (см. табл. 7 ).

Ингибитор проявляет антивирусное действие при добавлении лишь в течение 0,5 ч после заражения монослоя, действуя на этапы репликативного цикла вируса (фиг. 1 ).

H а фи г. 2 представлены данные о влиянии макромолекулярного инги909814 битора на синтетические процессы в нормальных и инфицированных вирусом

ВЭЛ клетках ФЭК, оцениваемые по включению Н -урндина: ингибитор

9 вирусной активности. не снижает синтеза PHK в нормальной клетках ЗЭК 5 (фиг. 2, б ) и вызывает полную нормализацию синтеза в клетках ФЭК, инфицированных вирусов ВЭЛ (фиг. 2,г ), На фиг. 3 показано подавление вирус- индуцированных синтезов (б ) при действии ингибитора на фоне актиномицина Д.

В табл. 1 представлены данные об изучении гидролитической (рибонук-леаэной: активности ингибитора вирусной активности, полученного по заявленному способу, в отношении дрожжевой PHK в сравнении с таковой панкреатической рибонуклеазы, которая использовалась в процессе полу- . чения ингибитора вирусной активности..Из данных, представленных в табл. 1, следует,.что ингибитор вирусной активности осуществляет гидролиэ дрожжевой PHK в равной мере с используемой для его получения ри- 25 бонуклеазой, которая не подвергалась термическим воздействиям. Последнее обстоятельство находится в соответствии с литературными данными о термостабильностн рибонуклеазы.и, ка- .30 зались, может свидетельствовать в пользу того, что антивирусное действие ингибитора связано с сохраняющейся в нем рибонуклеаэной активностью. Однако используемая нами 35 в контрольных опытах рибонуклеаза, применяемая также в концентрации

350 мкг на 1 мп инфицированной культуры, не оказывала никакого антивирусного действия (..см. табл. 4, группы 4-10 ). Задержка развития цитопатического действия вирусов была получена при использовании рибонуклеазы в концентрации 1000 мкг/мл (см. табл. 5, 9 п.п 11).

Таким образом, предложенный йн- 45 гибитор вирусной активности представляет собой новую макромолекуляр-:. иую структуру.

Антивирусное действие ингибитора не связано с синтезом интерферо- 5р на, подавлением метаболизма клеток или с непосредственным гидроло- . гическим действием нуклеазы на вирус» ную нуклеиновую кислоту. Антивирусные свойства ингибитора находятся, как видно, в зависимости от присутствия в нем субстанций белковой природц, являющихся составными частями зараженных клеток и рибонуклеазы, объединенных в макромолекулярный комплекс. Присутствие в .ингибиторе 60 относительно большого количества азота и фоСфора не исключает наличия в нем олигонуклеотидов вирусноro и клеточного происхождения. Заявляемый макромолекулярный ингибитор вирусной активности действует как на

PHK-, так и ДНК-содержащие вирусыр нетоксичен и не снижает синтез клеточных макромолекул, прост в получении, вызывает защиту клеточного монослоя от цитопатическог действия вирусов и подавление репродукции вирусов; вызывает полную нормализацию синтеза PHK вирусинфицированных клеток; чувствителен к трипсину, обладает рибонуклеазной активностью, термостабилен (95 С, 60 MHH ).

Пример 4. Вышеуказанные свойства вещества найдут широкое применение в вирусологических исследованиях.

Моделирование хронической инфекции и персистирование вирусных агентов в культуре ткани.

В качестве примера приводим данные о персистировании вируса

ВЭЛ в культуре ФЭК, полученные при использовании ингибитора вирусной активности. 48-часовую культуру ФЭК инфицировали вирусом ВЭЛ (0,.0001 ТЦД на клетку ) без макромолекулярного ингибитора вирусной активности и в присутствии последнего, который вносили в объеме 0,2 мл на 1 мл культуральной среды. Имелись соответствующие беэвнрусные контроли, где культивирование ФЭК проводили в присутствии одной культуральной среды и культуральной среды с ингибитором вирусной активности. Первый субпассаж в группах 1-3 (cM. табл.8) проводили после развития цитодеструк. тивных изменений в группе 4, где инфицирование клеток осуществляли без добавления макромолекулярного ин-. гибитора вирусной активности, последующие субпассажи проводили после образования монослоя в группах

1-3. В субпассажах повторное добаВление ингибитора проводили на следующие. сутки после пересева культуры в объеме 0,04 мл на 1 мп культуральной среды. Вирусологические исследования проводили путем сокультивирования субпассируеьых клеток с первично трипсинизированными клетка ми ФЭК; кроме того, на наличие вируса исследовали бесклеточную культуральную жидкость иэ пеРевиваемых тканевых культур, инфицированных вирусом ВЭЛ при добавлении ингибитора вирусной активности (данные вирусологических исследований отражены в табл. 9 ).

Как видно иэ данных, представлен-, ных в табл. 8, вирус ВЭЛ, вносимый без макромолекупярного ингибитора вирусной активности, вызывает развитие цитопатических изменений и деструкцию клеточного монослоя первичной культуры ФЭК, исключая тем са дым возможность последующего куль тивирования клеток. Добавление ингибитора вирусной активности пол909814 ностью блокирует развитие цитодеструктивных изменений в первичной культуре, что позволяет осуществить дальнейшее субпассирование первично трипсинизированных клеток ФЭК. Блокирование цитодеструктивных изме- 5 нений в этой группе подтверждается и данными по концентрации клеток на 1 мл снятого трипсином монослоя (поскольку клетки пересевались в отношении 1:1, то посевная доза, указанная в субпассажах, отражает урожай клеток предшествующего монослоя ). Видно, что количество клеток при снятии монослоя первичной культуры ФЭК в Группе 3 (ВЭЛ +ингибитор вирусной активности ) практически такое же, как и в основной контроль-. ной группе, где не проводилось инцифирование вирусом ВЭЛ и- не добавлялся макромолекулярный ингибитор (соответственно 837000 и 836000 клеток/мл ).

Образование моиослоя происходило

Ф при последующем субпассировании культуры, несмотря на персистирование вируса ВЭЛ.в клетках ФЭК что 25 подтверждается данными вирусологических исследований (см. табл. 9 ).

ПредставленныЕ в табл. 9 результуты указывают на то, что имеет место персистирование вируса ВЭЛ в клет-30 ках ФЭК, так как иэ культуральной жидкости вирус выделен не был.

Таким образом, результаты представленные в табл. 8 и 9, указывают на наличие персистентной инфекции в клетках ФЭК и свидетельствуют о возможности использования ингибитора вирусной активности для изу — . чения молекулярно-биологических механизмов хронических вирусных инфекций.

Характеристйка РНК-полимеразных реакций вирусных агентов.

Исследования проведены с вирусом гриппа A (FPV) Rostoc/34. Установлено, что макромолекулярный инги- 45 битор вирусной активности, внесенный в культуру ФЭК сразу после заражения ее вирусом, при последующем анализе (invitt o) полимеразной активности микросомальной фракции ви- 50 русинфицированных клеток проявил

95%-ное ингибирование синтеза вирусспецифической РНК по сравнению с контролем. Кроме. того, ингибитор ак.тивно утилизируется клетками, так как внесение его в культуру за 30 мин до заражения вирусом практически не влияло на полимеразную активность микросомальной фракции вирусинфици, рованных клеток.

Указанные свойства ингибитора вирусной активности позволяют наметить пути и способы блокирования

РНК-полимеразных реакций вирусных агентов при .помощи биологически активных клеточных метаболитов., 65

Избирательное подавление синтеза вирусной PHK (ингибитор вирусной активности как модулятор нуклеолнтической активности, направляющий действие фермента на блокирование синтеза вирусных, но не клеточ" ных РНК ).

Ниже представлены данные, свидетельствующие о возможности использования ингибитора вирусной активности для избирательного подавления синтеза вирусных PHK.

Нуклеолитическая активность ингибитора вирусной активности и панкреатической рибонуклеазы, используемой для его получения, является одинаковой (см. табл. 1 ). В этой связи исследованы особенности действия фермента (панкреатической рибонуклеазы )и ингибитора на синтез вирусспецифических и клеточных PHK в клетках ФЭК1 инфицированных вирусом ВЭЛ. Вирусспецифические синтезы изучались на фоне актиномицина Д; клеточные — без использования ука эанного антибиотика. Результаты исследований представлены на фиг. 4 и 5.

Панкреатическая рибонуклеаэа (фиг. 1, группа 3) резко подавляет (P (0,001) синтез вирусспецифической РНК вируса ВЭЛ. Однако это не сопровождается восстановлением синтеза PHK инфицированных клеток — в присутствии вируса ВЭЛ и панкреатической рибонуклеазы он достоверно ниже, чем при инфицировании клеток только вирусом ВЭЛ (фиг. 4, соответственно группы б и 5 ).

Совершенно другие закономерности в отношении синтеза клеточной

PHK в вирусинфицированных клетках были установлены при действии ингибитора вирусной активности, который, как указывалось выше, по нуклеолитической активности не отличался от панкреатической рибонуклеазы.

Как видно из данных, представленных на фиг. 5, группа б, добавление ингибитора вирусной активности при инфицировании клеток вирусом ВЭЛ приводит к сохранению синтеза клеточной РНК на уровне неинфицированного контроля (фиг. 5, группа 4 — неинфицированный контроль). При этом следует заметить, что синтез вирусоспецифической РНК вируса ВЭЛ ингибитор вирусной активности угнетает также, как панкреатическая рибонуклеаза (фиг. 5. группа 3).

Таким образом, представленные данные свидетельствуют о способности ингибитора вирусной активности избирательно подавлять синтез гетерогенных для клетки нуклеиновых кислот, что указывает на возможность создания биологически активных веществ, контролирующих клеточную индивидуальность на генном уровне.

9 909814

Изучение начальных этапов репродукции вирусных агентов.

Т а б л и ц а 1

М

Сравнительная характеристика гидролитической активности ингибитора и панкреатической рибонуклеазы по отношению к дрожжевой PHK

Разведения ингредиентов, обЪем и количество

РНК-аэы, используемой для гидро-лиза РНК. Количество распавшейся PHK (на 1000 мкг) после инкубации с исследуемыми ингредиентами, мкг

Исследуемые ингредиенты

Панкреатическая рибонуклеаэа 1 750 мкг/мл (молекулярная масса

12000 ) 10000 раз

0,25. мп

43 нг

850

Ингибитор вирусной активности (1 мп. молекулярная масса 190000 ) 10000 раз

0,25 мп

43 нг+

845

П р и м е ч а н и е " — указано ожидаемое количество PHK-азы, исходя иэ расчета добавляемого количества фермента при изготовлении ингибитора вирусной активности.

Таблица 2

Характеристика гемагглютинирующей активности ингибитора и составляющих его компонентовРазведения исследуевнх ингредиентов и учет гемагглютинации

Исследуемые ингредиенты

Фф

1/2

1/4 1/8 1/16 1/32

Ингибитор

++++

++++

++++ +Панкреатическая

PHK-аэ а

Вируссодержащая суспензия ВЭЛ

Все исследуемые ингредиенты инкубировались при 92 С 30 мин

Клетки ФЭК заражали вирусом гриппа А (FPV) Rostoc/34 и через 30 мин обрабатывали ингибитором вирусной активности. В результате последующего фракционирования клеток, проведенного через 60 мин после заражения, установлено, что испольэуемый ингибитор снизил содержание меченых вирусных структур в цитоплазматической фракции клеток на 76% и в ядерной на 69%. Полученные данные позволяют заключить, что

5 ядерная и цитоплазматическая фазы репродукции вируса гриппа обладают одинаковой чувствительностью к вирусингибирующим веществам макромолекулярной природы.

909814

Таблица 3

Влияние трипсина на вирусннгибирующне свойства и нги битора

Оценка активного действия

Исследуемые ингредиенты цитопатогенное действие вируса ВЭЛ подавление накопления вируса ВЭЛ в ZS ТОЛ

7,50

Ингибитор

Ингибитор + трипсин

++++

П р и м е ч а н и ег исследование проведено с вирусом ВЭЛ, трипсин использовался s концентрации 250 мкг/мл, не оказывающей токсического действия на культуру,клеток ФЭК.

Таблица4

Влияние антисыворотки к панкреатической рибонуклеаэе на вирусингибирующую и ферментативную активность" > ингибитора

5 м

Оценка антивирусного действия

Исследуемые ин гредиен ты цитопатогенное действие вируса ВЭЛ

845.

7,50

Ингибитор

Ъ

Ингибитор + антисыворотка против

РНК-азы

890

Ингибитор + нормальная сыворотка

850

7,50

П р и м е ч а н и е: разведения исследуезаих ингредиентов и их объем, используемлй для гидролиэа с РНК, так и в таблице 1; подавление накопления вируса ВЭЛ в 8 ТШ 5О) Количество распавшейся

PHK (иэ 1000 мкг) после инкубации с исследуемыми ингредиентами, мкг

909814

Опыт (группы1" 3) 7,50

7,00

4,00

5.

++++

+++ +

7., PHK-аза,. инкубируемая при 92 С, 30 мин (350 мкг ) 8.

++++

РНК-аза, инкубируемая при 95 С, 60 мин (350 мкг ) 0

++++

PHK-аза, инкубируемая при 56 С, 20 мии (350 мкг ) 9.

Нативная PHK-аза (350 мкг ) 10, 0

++++

Нативная PHK-аза

1000 мкг

1,00

++++

Контроли к опытным группам (группы 4-15 ) 1 Таблица5

Вирусингибнрующее действие ингибиторов, полученных как описано в примерах 1-3

Ингибитор, . полученный из инфицированных клеток по примеру 1 (PHK-аза, 92 С, 30 мин) Ингибиторq полученный из инфицированных клеток по примеру 2 (PHK-аза,.

95 С, 60 мин ) Ингибитор, полученный иэ инфицированных клеток по примеру 3 (РНК-аза, 56 С, 20 мин ) Супернатант„ полученный из неинфицированных клеток по методике, используемой в примере 1 (РНК-аза, 92 С, 30 мин) Супернатант, получениый из неинфицированных клеток по методике, используемой в примере 2 (РНК-аза, 95 С, 60 мин) Супернатант, полученный из неинфицированных клеток по методике, используемой в примере 3 (РНК-аза, 56 С, 20 мин) 16

909814

Продолжение табл. 5

Группы

Исследуемые ингредиенты

Оценка антивирусного действия подавление накопления вируса ВЭЛ в 18 ТЦД уо» цитопатогенное действие вируса ВЭЛ

Вируссодержащая суспензия, инкубированная прй 92 С 30 мин (без PH K-а зы) 12.

Вируссодержащая суспензия, ннкубируемая при 96 С 60 мин (без PHK-азы i

13.

++++

14.

Вируссодержащая суспензия инкубируемая при 56 С 20 мин

Л без. PHK-азы

Интерферон 16 ед/мя

15.

16.

Титр вируса ВЭЛ в клетках ФЭК со средой 199-8,5 Хд ТПД 0

П р и м е ч а н и е: исследуемые ингредиенты вносились в 48-часовув культуру ткани ФЭК одновременно с инфицированabw вирусом ВЭЛ в дозе 10000 ТЦД Oj01INA

Ингредиенты 1-14 вносились в объеме 0,2 мп на 1,мл тканевой культуры ФЭК, в Р пп 15 вместо среды 199 внесен интерферон в объеме 1,2 мл.

Учет цитопатогенного действия (+ миним., ++++ максимальное, - отсутствие } и накопление вируса оценивалось через 48 ч после инфицирова ния. Подавление накопления вируса ВЭЛ оценивалось по разности титров в группах 1-15 с титром вируса в группе 16 (ФЭК -ВЭЛ+среда 199 ).

Табли-цаб

Определение интерферона в клетках ФЭХ после внесения ингибитора вирусной активности и вируса болезни Нъвклела (ВБН )"

Время определения и титр интерферона, ед/мл

Исследуемые ин гредиенты

24

16

ВБН

Ингибитор вирусной активности

18

909814

Т а б л и ц а 7

Влияние ннгибитора вирусной активности на цитопатогенное действие и накопление некоторых

PHK- и ДИК-содержащих вирусов

Оценка антивирусного действия

Инги битор (в мя на

1 мл тканевой культуры) Вирусы

Подавление накопления вирусов йд ттЩ50

Цитопатогенное действие вирусов

7, 50.

0 2

4,00

3,50

0,2

ВВС

Грипп (FPV) О,б ерпес

3,50

0,2

Ф

Таблица8

Характеристика состояния монослоя и количество клеток/мл в,первичной культуре ФЭК и Субпассажах

Первичная культура:

1- субпассаж

Il- субпассаж

99 пп

Группы

1 ФЭК (контроль) 800000

Ионослой 836000 Ионослой 528000 Ионослой

2 ФЭК+ ингибитор .

То же 814000 Ионослой 4б2000 То же

То же

837000 То же 913000

3 ФЭК+ВЭЛ

+ингибитор

Субнассирование . не проводилось из-за деструкции монослоя первичной культуры

««««««««««««««««

4 ФЭК+ВЭЛ (без ингибитора) посевная доза клеток на

1 мп состоя ние куль ðí клеток

Цитодесструкц монослоя посевная доза клеток на

1 мп

СОСТОЯ ние культуры клеток посевная доза клеток на

1 мл состояние куль-. туры клеток

90981

Таблица9, Выделение вируса ВЭЛ из клеток ФЭК при действии

I ингибитора вирусной активности

Используемые культуры жизнеспособные клетки культуральная жидкость заражение монослоя

ФЭК сокультивирование с первично трипсиниэированными ФЭК Монослой первичной культуры

Монослой 1 субпас-сажа

Монослой II субпассажа

+ выделен вирус ВЭЛ; - вирус ВЭЛ не выделен

1 Я Л 4 6 7 Э (Риг. 1

Дествие ингибитора, обладающего противовирусной ак тивностью.на накопление вируса ВЭЛ в первые 8 ч после заражения (вирус и ингибитор внесены одновременно).

1ФО

Cs

7

4 а f ф

Ь

%. 2 ,Ъ

I- Ъ

Используемый материал и способ выделения ( вируса

909814

24

Влияние ингибитора вирусной активности на синтез вирусспецифических и клеточных РНК в ФЭК, инфицированных вирусом ВЭЛ.

1. ФЭК+акт. Д

2. ФЭК+акт. Д+ВЭЛ

3. ФЭК+акт.Д+ВЭЛ+ангибитор вирусной активности.

4. ФЭК.

5 ° ФЭК+ВЭЛ. б . ФЭК+ВЭЛ+ангибитор вирусной активности.

Заказ 6323/1 Тираж 713 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретениЯ и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул. Проектная, 4!

Редактор П. Горькова Техред,И.Метелева Корректор,В. Бутяга

° 22

909814

Включение Н -уридина в клетки ФЭК: а) контроль (100%), б) ФЭК + ангибитор вирусной активности; в) ФЭК + вирус ВЭЛ г). ФЭК + вирус ВЭЛ + ингибитор вирусной активности. б). вирус ВЭЛ+акт.Д ингибитор.

+e

13 pN 51М

2 Я ф фМ,ф

Влияние панкреатической PHK на синтез вирусспецифических и клеточных РНК в ФЭК, инфицированньж вирусом ВЭЛ

1.. ФЭК+акт.Д.

2. ФЭК+акт.Д.+ВЭЛ.

3. ФЭК+акт.Д+панкреатическая PHK.

4, ФЭК

5. ФЭК+ВЭЛ.

6. ФЭК+ВЭЛ+панкреатическая PHK.

Ва Ф

Ф .я

Влияние ингибитора на вирусиндуцированный синтез РНК вируса ВЭЛ. а) вирус ВЭЛ+акт.д (вирусиндуциро":.- ванный синтез РНК, принят эа 100%), 1 ф ф ф

b фйЮ

Ъ ь5У

4 ф

Ъ ъ

Ъ 6

Фв