910117 - Способ получения продукта присоединения дипептидного производного и аминокислоты

Способ получения продукта присоединения дипептидного производного и аминокислоты

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОП ИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕ Н Ия

К ЙАТЕМУУ

С©аз Советева

Социалмстмввснмд реслублнн д)19 10 1 1 7 (61)дополнительный к патентувЂ” (32) Заявлено 26.01. 78(21) 2570052/2g-04 (51) М. Кл.

С 07 С 103/52 А 61 К 37/02 (23) ПриоритетвЂ” (32) 27. 01. 77

Веударатеаивй кемитвт

CCCP ао делам язеврвтввяв и открытей (31) 7279/1977 (331 Япония (5З) УЙК 547.964. .4.07(088.8), Опубликовано28.02.82.Бюллетень ) с 8

Дата опубликования описания 23.04.82

Иностранцы

Есиказу Изова, Иунеки Охмори, Као

Юдзи Нонака, Кейити Кихара, Кийота и Сигеаки Нисимура (72) Автори изобретения ва, ато, (Япония)

Иностранная бирма

"тойо сода дануаакчурингKo.,лтди(одйданкойдаион)санаки Й икал

Рисерч Сентер" (Япония) (71) Заявитель (54) CflOC05 flOJlWEHNR ПРОДУКТОВ ПРИСОЕДИНЕНИЯ

ДИПЕПТИДНОГО ПРОИЗВОДНОГО И АИИНО!(ИСЛОТЫ

О щ 0

Il II 1 Н И

Кд С CH 2K НОС. (СН СН C-ME CE С R

2, ЙУЛИ . т ) 3

Ra Ba

Изобретение относится к способу получения новых продуктов присоединения дипептидного производного и . аминокислоты, соединений, обладающих биологической активностью, которые могут найти применение в биохимии и медицине.

Известно применение протеаз (таких как папаин, химотрипсин) для образования пептидных связеи ° Таким способом были осуществлены белковые синтезы из моноаминокарбоновых кислот, таких как лейцин, имеющих N-концевую защитную бензоильную группу, и лейцин глицин, обе из которых имеют С-конце.вую защитную группу (1 .

При этом продукты реакции осажда-. лись в водной среде и как водонерастворимые при потере водорастворимых групп (что необходимо для сдвига обратимой реакции в сторону, образования белка) ° В случае, когда водораствори"

g. мая группа сохраняется в реакционном продукте, например, как в случае использования в качестве исходного соединения дикарбоновых аминокислот, необходимо водорастворимую группу ис1в ходного соединения закрыть менее гид" родильной защитной группой.

Цель изобретения - новый способ

I получения новых биологически активных

:соединений.

И1 Поставленная цель достигается тем,,что в способе получения продуктов

,присоединения дипептидного производного и аминокислоты общей формулы

3 9101 где R< вЂ” бензилоксикарбонил, пара-ме= токсибенэилоксикарбонил;

Й вЂ” бензил;

Pi вЂ” метокси, этокси-группы; и -1или2

N-замещенную аминодикарЬоновую кислоту общей формулы, 1

II P II. (11) нос-(сн,)„- ск- со8 где значения Я.1 и и указаны выще, подвергают взаимодействиф со сложным эфиром аминокарбоновой кислоты общей формулы

321% CK- C E3 (yg) !

20 2 ! где значения R и R указаны выше.

При яолярном соотношении исходных соединений формул II. и Н1 1:1 - 1:

;3,75, в водной среде, в присутствии металлопротеазы при рН 5,0«j,2, температуре 10-90 С. Продукты, полученные в процессе реакции, мало растворимы в воде и выпадают в осадок. Кроме

30 того, предлагаемый способ позволяет получить оптически активный продукт присоединения дипептида и сложного эфира аминокислоты из рацематов, по скольку реакция образования пептидной связи при этом происходит только на

L-изомерах. С другой стороны, сложные эфиры аминокислот, используемые для проведения реакции присоединения с образованием продуктов присоединения, могут быть либо, в Е-форме, либо в

D-форме, либо их смесью.

При использовании DL-формы сложного эфира аминокарбойовой кислоты I.изомер DL-формы сложного эфира аминокарбоновой кислоты расходуется в про- 5 цессе пептидного синтеза при получении продукта присоединения, остающийся сложный эфир аминокислоты имеет

D-форму., Если концентрации исходных веществ 0 высоки1процесс проходит с количественным выходом. При использовании двух молей DL-формы сложного эфира амино. карбоновой кислоты на 1 моль L-формы.

N-эамещенной моноаминодикарбоновой N кислоты получают продукт присоединения, состоящий в основном из LL-дипептидного сложного эфира и сложного

17 4 эфира D-аминокарбоновой кислоты. Полученный продукт присоединения может

Ьыть легко разделен на два частичных компонента, т. е. íà LL-дипептидный эфир и сложный эфир D-аминокислоты.

Таким образом, предлагаемый способ может одновременно обеспечить получение дипептидного эфира и оптическое разделение сложного эфира DL-аминокарбоновой кислоты.

Отделенную D-форму или обогащенную D"ôoðèó сложного эфира аминокислоты можно рацемизовать обычным способом, и полученный продукт использовать в качестве исходного вещества в описываемом способе.

При использовании DL-формы N-замещенной моноаминодикарбоновой кислоты и L-формы сложного эфира аминокислоты

D-изомер из DL-формы N-эамещзнной моноаминодикарбоновой кислоты, явля" ясь инертным, остается в водной среде, в результате чего может быть получен продукт присоединения LL-дипептидного сложного эфира и сложного эфира

L-аминокарбонэвой кислоты. Соответственно, если D-форму N-замещенной моноаминодикарЬоновой кислоты выделяют из водной среды, то это может одновременно обеспечить получение продукта присоединения и оптическое разделение

N"3àìåùåíHîé DL-моноаминодикарбоновой кислоты. Если выделенную N-замещенную

13-моноаминодикарбоновую кислоту рацемизировать известным способом, то полученный продукт может быть использован в качестве исходного вещества. При использовании DL" îðèû Х-замещенной моноаминодикарбоновой кислоты и DLформы сложного эфира аминокарЬоновой кислоты из водной среды может Ьыть получена N-замещенная DL-моноаминодикарбоновая кислота, а также продукт присоединения LL-дипептидного сложного эфира и сложного эфира D-аминокарбоновой кислоты, причем укаэанный продукт присоединения разделяют на компоненты, как указано выше. Одновременно может быть достигнуто образование дипептидного сложного эфира и оптическое разделение N-замещенной

DL"моноаминодикарбоновой кислоты и сложного эфира DL-аминокарбоновой кислоты.

Предлагаемый. способ позволяет исключить стадии введения и удаления защитных групп в боковой цепи, которые считаются неизбежными в известных

5 9101 способах, что соответственно позволяет предотвратить потерю исходных веществ; а также использовать DL-форму исходных соединений, В обычных спосоЬах с использованием фермента D-изо- 5 мер DL-формы исходных веществ не нужен в реакции, и хотя он не влияет на ход реакции, но вызывает потерю исходных веществ. Однако D-форму исходных веществ можно с успехом использовать в качестве агента для осаж дения пептида с последующим их восстановлением.

Таким образом, при осуществлении предлагаемого способа может быть одновременно достигнуто оптическое разделение N-замещенной DL-аминодикарбоновой кислоты и сложного эфира DI,аминокарбоновой кислоты.

Продукты присоединения имеют ха- 20 рактеристики, которые можно ожидать на основании формулы 1. Например, типичный продукт присоединения, полученный реакцией N-бензилоксикарбо-. нил L-аспарагиновой кислоты и метилового эфира L-фенилаланина, дает поглощение в инфракрасном диапазоне и спектр ЯМР, указанные ниже.

Инфракрасный спектр: 3260 см г (колеЬание растяжения связи N-Н); Зо

3000-3200 см (колебание растяжения связи С вЂ” Н); 1740 см (сложный эфир

C=0); 1720 см " (C=O уретан):, 1660 см (1-ое амидное поглощение); 1630 см (карЬоксилат); 1540 см (2-е амидное поглощение}; 1430 и 1450 см (С=Н деформационное колебание);

1390 см (êàðáîêñèëàò); 1200 и

1290 см (С-О-С колебание растяжения связи и )-е амидное поглощение);

1050 см (колебание фенила в плос" кости); и 740 и 695 см г(колебание монозамещенного Ьензольного кольца вне плоскости).

ЯМР-спектр, 6: (1) 2,75 ppm (2Н); (2) 3,02 рун (4H); (3) 3,61 ppm (3H);

3,7 ppm (3H); (4) 4,4-4,8 рун (3Н); (5) 5,05 ppm (2И); (6) 5,82 ppm (5H); (7) 7,3 ppm (15H) °

Результаты элементарного анализа

50 продукта присоединения оказались такими же, что и рассчитанные значения для формулы I где значения R<, Rp, R и и указаны выше. Когда продукт присоединения обрабатывают сильной кислотой, такой как соляная, и полученный продукт экстрагируют из органического растворителя, такого как этилацетат, то из органи-.

17 ческого слоя получают кислотное соединение. При обработке продукта присоединения указанным образом получают кислотное соединение с характеристи" ками и свойствами, отвечающими соединению формулы

0 ЖП.1 О Q

II, ll u

HOC (иД„-СК-CHH СНС-Rg (И)

R в LL-форме, где R„, Rz,, R и Б. имеют те же значения, что и в продукте при" соединения.

Кислотное соединение, полученное из продукта присоединения при каталитическом восстановлении дает известное соединение вЂ” метиловый эфир

Результаты анализа соединений, полученные на основании инфракрасных спектров, спектр ЯМР и элементарного анализа подтверждают структуру соединения формулы I. Полностью совпадаювЂ” щие. результаты получены также и в случае, когда выбраны соединения с другими значениями R1, R, R и и.

Протеазы, используемые в предлагаемом способе, являются металлопротеазами, имеющими металлический ион в активном центре. Пригодными металлопротеазами являются ферменты, полученные из микроорганизмов, такие как нейтральные протеазы из актиномицета, пролизин, термолизин, коллагеназа, протеаза Crotulus atrox и т. д. Могут быть использованы также -неочищенные ферменты, такие как термоаз, тациназа-N, проназа и т. д. Чтобы подавить действие эстеразы, содержащейся в неочищенных ферментах, предпочтительно использовать ферментный ингибитор, картофельный ингиЬитор вместе с неочищенными ферментами. Используют тиольные протеазы, папаин или сериновые протеазы, трипсин, однако они оЬладают эстеразной активностью. Поэтому, во время проведения реакции с использованием таких ферментов неоЬходимо принять меры для предотвращения гидролиза сложных эфиров.

Пример 1. 1335 мг (5 ммоль)

8-бензилоксикарЬонил L-аспарагиновой кислоты и 1078 мг (5 ммоль) хлоргидрата метилового эфира L-фенилаланина . помещают в 30 мл колбу и добавляют

20 мл, воды до их растворения, рН доводят до 6 с помощью 74-ной аммиачной

7 9" 01 воды. Полученный раствор смешивают с

50 мг термолизина, смесь встряхивают при 38-40 С в течение ночи. Выпавший осадок отфильтровывают и промывают

ФО мп воды и сушат. Получают 1145 мг

:тонких игольчатых кристаллов, имеющи> т. пл. 117-120 С (продукт присоедине,ния метилового эфира N-бензилоксикарбонил L-аспартил-1.-фенилаланина и метилового эфира Ь-фенилаланина (1: 1); 1о выход 75,54 в расчете на хлоргидрат метилового эфира"фенилаланина).

После перекристаллизации из смеси растворителей этилацвтата и н-гексана физические свойства и результаты; 1$ элементарного анализа продукта следующие: т. пл. 120-124 С; (4.) = +

+ 7,1 (C=l, метанол).

Йайдено, б: С 63, 15; Н 6, 15; N 7,00

С Нр Ay0g

Рассчитано, 4: С 63,24; Н 6, 13;

Х 6,97.

Сняты ИК-спектр и спектр lH-ЯИР продукта.

1145 мг полученного продукта раст- 2з воряют в 40 мл 1 н . 1!СЕ и трижды экстрагируют 30 мл этилацетата. Экстракты объединяют и промывают водойу беря порции по 20 мл (3 раза), и сушат над безводным сульфатом магния. Раст- зо вор концентрируют и продукт перекрис". таллизовывают из н-гексана, получают

640 мг. Физические свойства и резуль" таты элементарного анализа Продуца следующие: т. пл. 115"125 С (4-)g =

-15,3 (С=1 метанол)

Найдено, ь: С 61,52; H y,65; Ж6,57

CgH@pil@0@

Рассчитано, 4: С 61,67; Н 5,65;

N 6,54.

Результаты инфракрасного спектра и ЯИР-спектра дают характеристики, ожидаемые в.метиловом сложном эфире

N-бензилоксикарбонил-L-acnapren-L-фе,нилаланина.

Полученные результаты совпадают с результатами исследования соединения, полученного при бензилоксикарбонилировании аминогруппы метилового эфира

L-аспартил-L-фенилаланина.

Иетиловый эфир L-фенилаланина выделяют из смеси солянокислой фазы и фракции промывочной воды, отделенной при экстракции из этилацетатной фазы.

Подтверждено, что соединение, полученное посредством первой реакциипродукт присоединения метилового эфира Х-бензилоксикарбонил-Ь-аспартил-L-фенилаланина и метилового эфира L17 8 фенилаланина. Спектром Н-ЯИР подтверждено, что их молярное отношение составляет 1:1.

Пример 2. 1335 мг (5 ммоль)

N-Ьензилоксикарбонил-L-аспарагиновой кислоты и 1078 мг (5 ммоль) хлоргидрата метилового эфира Ь-фенилаланина загружают в 30 мл колбу и к смеси добавляют 10 мл воды, до их растворения и рН раствора доводят до 6 с помощью 74-ной аммиачной воды. Полученный раствор смешивают с 50 мг термолизина, и смесь непрерывно встряхивают при 38-40 С в течение ночи. Осадок отфильтровывают, сушат, получают !

504 мг продукта присоединения метилового эфира N-бензилоксикарбонил-L-аспартил-фенилаланина и метилового эфира L-Фенилаланина (1: 1); (выход

99,1 в расчете на хлоргидрат метилового эфира L-фенилаланина, т. пл. 104 113 С

I1 р и м е р 3. Получение продукта и обработку реакционной массы проводят аналогично примеру 2, но изменяют количество N-бензилоксикарбонил-L-аспарагиновой кислоты и метилового эфи- . ра L-Фенилаланина на 534 мг (2 ммоль) и 863 мг (4 ммоль) соответственно, получают. 1068 мг продукта присоединения метилового эфира N-бензилоксикарбонил-L-аспартил- .- фенилаланина и метилового эфира Ь-фенилаланина (1:1).

Выход 70,44 в расчете на N-бензилоксикарбонил-Ь-аспарагиновую кислоту, т. пл. 116-119 С.

Пример 4. 534 мг (2 ммоль)

N-бензилоксикарбонил-L-аспарагиновой кислоты и 863 мг (4 ммоль) хлоргидрата метилового эфира L-фенилаланина загружают в 30 мп колбу, растворяют в 8 мл воды, рН доводят до 6,2 с помощью 3-ной аммиачной воды. Полученный раствор смешивают с 50 мг термолизина, и смесь встряхивают при 38-40оС в течение ночи. Осадок отфильтровывают, отделяют от раствора и сушат, получают 1099 мг продукта присоединения метилового эфира N-бензилоксикарбонил-L-gcnaptea-L-фенилаланина и метилового эфира Ь-фенилаланина (1:1).

Выход 90,54 в расчете íà N-бензилоксикарбонил-Ь-аспарагиновую кислоту.

Пример 5. 267,2 мг (1 ммоль)

N-бензилоксикарбонил-1.-аспарагиновой кислоты и 537,.6 мг (3 ммоль). метилового эфира L-фенилаланина растворяют в 5 мл буферного раствора Мак-Илвай117 l.0

9,910 на (рН 7,0), Полученный раствор смешивают с 100 мг термоазы и 100 мг t картофельного ингибитора, и смесь встряхивают в течение 20 ч при 38 С °

Осадок отфильтровывают и промывают водой и сушат, получают 580 мг неочищенного кристаллического продукта присоединения метилового эфира N-бензилоксикарбонил-L-аспартил-L-фенилаланина и метилового эфира Ь-фе- io нилаланина (1:1). Выход .95,Q в расчете на И-бензилоксикарбонил-L-аспаргиновую кислоту, т. пл. 123-125 С.

Продукт растворяют в 40 мл смеси диметилформамид и вода (1: 1), и к is раствору добавляют при перемешивании

Н-форму сильнокислотной катионообменной смолы, которую затем отделяют и фильтрат концентрируют при пониженном давлении. Остаток растворяют в диме- 20 тилформамиде и к раствору добавляют воду, в осадок выпадает 330 мг метилового эфира N-,áåíçèëîêñèкарбонил-Ь-аспартил-Ь-фенилаланина, выход 77,0Ф в расчете на N-бензилоксикарбонил-Ь- zs

-аспарагиновую кислоту, т. пл. 123l25 C.

Пример 6. 267,2 мг (1 ммоль)

N-бензилоксикарбонил-Ь-аспарагиновой, кислоты и 537,6 мг (3 ммоль)- метило" вого эфира L-фенилаланина растворяют в 5 мл буферного раствора Мак-Илвайна. (рН 7,0). Полученный раствор сме" шивают со 100 Mr тациназы И и со

100 мг картофельного ингибитора, Э5 смесь встряхивают в течение 6 ч при

38 С. Осадок отфильтровывают, промы47 вают водой и сушат. Получают 120 мг неочищенного кристаллического продук.та присоединения метилового эфира N-бензилоксикарбонил-Ь-аспартил-Ь-фенилаланина и метилового эфира L-фенилаланина (1: 1) выход -19,74, т. пл. I19-123 С.

Согласно примеру 5,продукт обраба- 4 тывают сильнокислотной катионообменной смолы в Н-форме, получают 50 мг метилового эфира N-бензилоксикарбонил-L"àñïàðòèë-L-фенилаланина. Выход

11 74, т. пл. 95"105 С °

Il p и м e p 7. 1335 мг (5 ммоль)

И-бензилокси карбонил-L-аспара гиновой кислоты и 1078 мг (5 ммоль) метилового сложного эфира Ь-фенилаланина загружают в 30 мл колбу, добавляют

4 мл воды, рН полученного раствора доводят до 6,8 с помощью тризтиламийа, добавляют 20 мг термолизина смесь"встряхивают йри 38-40"C в течение 2 дней ° Осадок отфильтровывают, промывают 40 мл воды, сушат, получа" ют.475 кг продукта присоединения иетилового эфира N-бензилоксикарбонил-L-аспартил-L-фенилаланина и метилового эфира L"ôåíènànàíèíà (1: 1). Выход 31,34 в расчете на хлоргидрат метилового эфира L-фенилаланина. После перекристаллизации из смеси этилацетата и н-гексана получают продукт с т. Пл. 120-124 С, (L) = + 7,2(C =

=1, метанол)

Элементарный анализ

Найдено, Ф: С 63,52; H 6,22; N 7,04

Рассчитано, 4: С 63,24; Н 6,13;

N 6,97

Пример 8. Процесс ведут аналогично примеру 7, но рН доводят до 5,2, получают 753 мг продукта присоединения метилового эфира И-бензилоксикарбонил-Ь-аспартил-Ь-фенилаланина и метилового эфира L-фенилаланина (1:1). Выход 49,5i в расчете на метиловый эфир Ь-фенилаланина.

Пример 9. K раствору 133,6 мг (0,5 ммоль) N-бензилоксикарбонил-Ь-аспарагиновой кислоты и 89,2 мг (0,5. ммоль) метилового эфира L-фенилаланина в 2,5 мл буферного раствора, Мак-Илвайна (рН 7,0) с 0,07 мл триэтил" амина, имеющему рН 6,7; добавляют

50 мг термоазы и 50 мг картофельного ингибитора, смесь встряхивают при

38 С в течение 20 ч. Осадок отфильт"

4t ровывают, промывают водой, получают

130 мг неочищенного продукта присое динения метилового эфира И-бензилок" сикарбонил-L-аспартил-L-фенилаланина и метилового эфира Ь-фенилаланина (1:1). Выход 85,54 в расчете на метиловый эфир Ь-фенилаланина, т. пл. 115124 С.

Раствор продукта растворяют в

20 мл смеси из диметилформамида и воды (t: 1), обрабатывают сильнокислот.

:ной катионообменной смолой в Н-форме согласно примеру 5, получают 75 мг ме-. тилового эфира И-бензилоксикарбонил:-ь"фенилаланина, полный выход 70ь в расчете на 503 количества исходного метилового эфира Ь-фенилаланина.

Пример 10. Реакцию проводят аналогично примеру 9, но используют

0,05 мл N-метилморфолина вместо

0,07 мл триэтиламина при начальном рН 6,4. Получают 120 мг неочищенного кристаллического продукта присоединения метилового эфира И-бензилоксикарбонилгЬ-аспартил-Ь-фенилаланина и

11 91 метилового эфира L-q>ewaaaa a (1:1), фиход 78,9 в расчете на метиловый эфир L-@ewaaaae sa, т. пл. 118-124 С, . Продукт обрабатывают сильнокислотной катионнообменной смолой в Н-форме согласно примеру 9, получают 70 мг кристаллического метилового эфира N-бензилрксикарбонил-Ь"фенилаланина.

Полный выход 664 в расчете на 503ное использование количества исходного метилового эфира L-®ewaana a.

ll р и м е р 11. Проводят реакцию аналогично примеру 4, но реакцию проводят при рН 6,5 при встряхивании в течение 1 ч, получают 920 мг продукта,присоединения метилового эфира N-бензилоксикарбонил-L-аспартил-L-Фе нилаланина и метилового эфира L-фенилаланина (1:1). Выход 75,83.

Пример 12. 524 мг (2 ммоль)

N-бензилоксикарбонил-Ь-аспарагиновой кислоты и 863 мг (4 ммоль)- хлоргидрата метилового эфира Ь-фенилаланина растворяют в 2 мп воды, к раствору добавляют 5,5 мг lн. NaOH до:рН 7.

Полученный раствор смешивают с

50 мг термолизина и смесь встряхивают при 38-40 C в течение 2 н. Осадок отфильтровывают, высушивают, получают 734 мг продукта присоединения метилового эфира N-бензилоксикарбонил-L-аспартил-L-gewaaaawvq и метилоаого эфира L"ôåíèëàëàíèíà (1:1). Выход 60,5l,т. пл. 106-»8 С.

П р. и м e p l3. 540 мг (2 ммоль)

И-бензилокси карбонил-L-аспарагиновой кислоты и 863 мг (4 ммоль) хлоргидрата метилового эфира L-Фенилаланина растворяют в 7 мл воды, рН раствора доводят до 6 с помощью 73-ной аммиачной воды, к раствору добавляют 100 мг термоазы, смесь встряхивают при 3840 С в течение ночи. Осадок отфильтровывают, промывают 70 мл воды, сушат., получают 550 мг продукта присо-. единения метилового эфира N-бензилоксикарбонил-L-.àñïàðòèë-L-.ôåíèëàëàíèíä (1:1). Выход 45,33, т. пл. 113-116©С.

Пример 14. 270 мл (1 ммоль)

N-бензилоксикарбонил-Ь-аспарагиновой кислоты и 432 мг (2. ммоль) метилового эфира Ь-фенилаланина растворяют в

4 мл воды, рН раствора доводят до 6 с помощью 73-ной аммиачной воды.

К полученному раствору добавляют

50 мг термоазы, смесь непрерывно встряхивают при 38-40 С в течение

40.ч. Осадок отфильтровывают, сушат, получают 177 мг продукта присоедине-.

0117 12 ния метилового эфира N-бензилоксикарбонил-Ь-аспаргил-L-фенилаланина и метилового эфира L-Фенилаланина (1: 1) ° Выход 29, 13 т. пл. 103-» 2 С, П р -и м е р 15 ° Процесс проводят аналогично примеру 14, но в раствор добавляют дополнительно еще 50 мг кар« тофельного ингибитора. Получают. 381 мг того же самого продукта. Выход 62, "., 10 т. пл. 105-» 7 С.

Пример 16. 534 мг (2 ммоль)

N-бензилоксикарбонил-L-аспарагиновой кислоты и 863 мг (4 ммоль) хлоргидрата метилового эфира D4-фенилаланина

1ю растворяют в 7 мл воды, величину рН доводят до 6,2 с помощью 74-ной аммиачной воды.

Полученный раствор смешивают с

50 мг термолизина и встряхивают в те20 чение ночи при 38-40 С. Осадок отфильо тровывают, сушат, получают 1045 мг . продукта присоединения метилового эфира И-бензилоксикарбонил-аспартил-.

-фенилаланина и метилового эфира Фенилаланина (1:1). Выход 86,13 в рас" чете на N-бензоилкарбонил-L-аспаргиновую кислоту, т. пл. 104-1084С.

После перекристаллизации из смеси этилацетата и н-гексана пол чают про3ф дукт с т. пл. 127-135 С,(Й ) = - 6,4 (С = 1, метанол).

Найдено, ь: С 63,52; Н 6,19; N6,92

ЕС g H qN 0 2

) Рассчитано, 4: С 63,24; Н 6,13; з

Иетодом ЯИР показана тождественность полученного продукта с продуктом присоединения метилового эфира

N-бензилоксикарбонил-Ь-аспартил-L4О

"фенилаланина и метилового эфира D-фенилаланина (1: l), т. е. соединение по примеру l.

800 мг продукта растворяют в 40 мг

1 н. НС1 и экстрагируют дихлорметаном, (30 мл х 3), органическую Фазу отде.ляют, промывают водой, сушат над безводным сульфатом, упаривают, остаток перекристаллизовывают из смеси этил- . ацетата и н-гексана, получают 450 мг кристаллического продукта, т. и. 124132 С, 34 ) = - 15,3 (С = 1 метанол).

Найдено, 3: С 61,38; Н 5,58; N6,29

Сйа Н24 И 6 у

Рассчитано, 4: С 61,67;.Н 5,65;

И 6,54.

Продукт представляет собой метиловый эфир И"бензилоксикарбонил-L-аспаргил-L-Фенилаланина.

13 910

Водную фазу после отделения слоВ дихлорметана смешивают с бикарбонатом натрия, значение рН доводят до

8,7, продукт трижды экстрагируют

30 мп хлористого метилена..Экстракт . s сушат над безводным сульфатом магния, в экстракт подают газообразный хлористый водород в течение 10 мин, затем упаривают досуха. Остаток перекристаллизовывают из этилового эфира, по- î лучают 29,0 мг хлоргидрата метилового

-Х;Ь-А@-Ь- Phe- NS L-phd -ИВ

ОСПдо (1:1) выход 64,84 в расчете íà N.-бензилоксикарбонил-L-аспарагиновую кислоту, т. пл, 105-110 С.

После перекристаллизации из смеси этилацетата и н"гексана, получают продукт с т. пл. 121«125еС ГМ ю

7,2 (С = 1, метанол) ..

35 Из оставшейся реакционной смеси выделяют N-бензилокси ка рбониласпарагиновую кислоту (в основном в D-форме) .

Пример 18..Используют оба

-рацемета

N вЂ” Z вЂ” Ш вЂ” As вЂ” изакер Ъ -изоиер

Остаепгя

N реикнибннОИ раст доре

pacmE0pewcw

З-Е-L-Asy-I.-Phe-Ne-D- Phe вЂ” Ms

Остать

1069 мг (4 ммоль) N-бензилокси карбонил-DL-аспарагиновой кислоты и!

863 мг (4 ммоль) хлоргидрата метилового эфира Ь-фенилаланина растворяют в 2 мл воды, значение рН доводят до б с помощью 7l ной аммиачной воды.

Полученный раствор смешивают с

50 .мг термолизина и встряхивают при

38-40еС в течение 2 ч. Осадок отфильтровывают, промывают 20 Mtl воды,. сушат, получают 787 мг продукта присоединения метилового эфира N-бензилоксикарбонил-L-аспаргил-Е-фeнилaлaнина и метилового эфира L-фенилаланина

Процесс проводят аналогично при-меру 17, но используют метиловый эфир

DL-фенилаланина вместо метилового

117 Ц эфира D-фенилаланина, . пл. Ai9l5l С, 33 р = - 15; 1 (С 1, метанол); (инфракрасный спектр и-спектр ЯИР совпадают со спектрами L-формы).

Таким образом, полученный продуктпродукт присоединения метилового эфира N-бензилоксикарбонил-L-аспартил-L-фенилаланина и метилового эфира 0фенилаланина (1:1) .

Пример 17 ° эфира L-фейилаланина. Получают

756 м1- продукта присоединения метилового эфира N-бензилоксикарбонил-L)15 9101

-аспартил-I,-фенилаланина и метилового эфира О-фенилаланина (1: 1). Выход

62,3ь в расчете íà N-бензилоксикарбонил-1.-аспарагиновую кислоту, т. пя. 105-111O С °

Продукт перекристаллизовывают из смеси этилацетдта и н-гексана, т.пл.

126-134 С, Ж1 = - 6,5 (С = 1, метанол). Из оставшейся реакционной смеси выделяют N-бензилоксикарбониласпара- 30 гиновую кислоту (в основном в D-форме).

Пример 19. 5,34 г (20 ммоль)

N-бензилоксикарбонил-L-аспарагиновой кислоты и 7,32 r (42 ммоль) метилово- 15 го эфира L-фенилаланина растворяют в

70 мл воды. Получают раствор с рН

6,2-6,3.

К раствору добавляют 200 мл термолизина и смесь непрерывно встряхивают щ в течение 4 ч при 38-40 С. Осадок отфильтровывают, промывают 70 мл воды, сушат, получают 10,11 г- продукта, (т. пл. 117"120 С).

Полученное соединение - продукт . 25 присоединения метйлового эфира N-бензилоксикарбонил-1.-аспартил-1.-фенилаланина и метилового эфира 1.-фeнилаланина (l:1), после перекристаллизации из смеси ацет та и н-гексана, т. пл, 120 З0

124 С, E*3p = + 7,2 (C = 1, метанол).

Найдено, Ф: С 63 16; Н 6,14; N6,99

С Н„N,О, Рассчитано, 3: С 63,24; 8 6,13

И 6,97. 55

Инфракрасный спектр и спектр ЯЙР показали те же характеристики, которые указаны выше для продукта присое-. . динения (1: I) метилового эфира И-бен« зилоксикарбонил-L-аспартил-L-фенил40 аланина и метилового эфира L-фенил" аланина. После обработки полученного продукта сильной кислотой> экстракции этилацетатом, последующей отганки ор-ганического растворителя получают ме", тиловый эфир Ы-бензилоксикарбонил-Ь-аспартил-L-фенилаланина.

1,00 r (1,65 ммоль) полученного продукта присоединения метилового эфира N-бензилоксикарбонил-L-acnap50 тил-L-фенилаланина. и сложного эфира

L-Фенилаланина загружают в 30 мл кол6у и добавляют 2 мл воды и 2,0 мл 1н.

НСЕ, смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 10 мин.

Суспензию Фильтруют, осадок промы"

55 вают 4 мл воды, сушат, получают

0,72 r метилового эфира N-бензилок17 16 сикарбонил-L-аспаргил-Ь-фенилаланина. Выход 98,84. После растворения в этилацетате продукт осаждают н-гексаном, т. пл. 121-124 -С, $41 >

-15,4 (С = 1, менол).

Найдено, 4: С 61,58; Н 5,64;

N 6,56 ° с и и,о

Рассчитано, 4: С 61,67; Н 5,65;

N 6,54..

Инфракрасный спектр продукта совпадает со спектром стандартного продукта.

Идентичность продукта подтверждена сравнением водного раствора полученного продукта с водным раствором стандартного соединения методом высокоскоростной жидкостной хроматографии. Чистота, измеренная этим способом, составляет 1003. Устройство для проведения высокоскоростной жид- костной хроматографии и условия ее проведения указаны ниже. Этот способ также использован для оценки чистоты продуктов разложения, продуктов присоединения в примерах, если это не оговорено иначе. То же устройство и те же условия использованы в примерах, если речь идет об этом способе.

Устройство для высокоскоростной жидкостной хроматографии (Т$К-HLC

801).

Колонка: внутренний диаметр 7,5 мм длина 30 см; наполнитель: крахмальный гель, размер частиц 5 мкм (TSK -

GEL Ю 170)...

Элюент: 0,54"ный водный раствор ацетата натрия.. Скорость потока

0,8 мл/мин перепад давления 20 кг/см,. температура измерения комнатная, де- тектор -. дифференциальный рефрактометре

Пример 20. 1,00. г,{1,65 ммоль) продукта присоединения метилового эфира N-бензилоксикарбанил-1.-аспартил-L-фенилаланина и метилового эфи" ра Е-фенилаланина, полученного в примере 19, растворяют s смеси 2 мл воды и 1,32 мл 1 н. НСс . Реакционную массу перемешивают при комнатной температуре в течение 10 мин и обрабатывают в условиях по примеру 19. Получают 0,70 r продукта в виде тонких призматических кристаллов. Содержание метилового эфира N-бензилоксикарбонил-1;аспартил-L -фенилаланина

96,8В т. пл. 100-,126 С.

Пример 21..18

17.

N- Z-L-Аф

910117 . DL вЂ” Phe-Ие

N-X вЂ” L-As)-Ь-Fhe -Ме В-Phe вЂ” Ие

ОС0ддя

®вЂ” мера 19, получают 0,35 г кристаллов метилового эфира N áåíçèëîêñèêàðáî" нил-L-аспартил-L-фенилаланина. Чистота 1004; выход 99 3 ь .

Пример 22.. К 0 50 r (0,82 ммоль) продукта присоединения метилового эфира N-бензилоксикарбонил-L-аспартил-L-

Пример 23. К смеси 0,45 r (0,82 ммоль) 853 муравьиной кислоты и 8 мл воды добавляют 0,50 г (0,82 ммоль) продукта присоединения метилового эфира N-бензилоксикарбонил-L-аспартил-L-фенилаланина и метилового эфира L-фенилаланина, полученного в примере 19, смесь перемешивают в течение 20 мин при.комнатной температуре, продукт отфильтровывают, промывают 10 мл воды, сушат,. получают 0,312 г белых кристаллов метилового эфира, N-бензилоксикарбонил-L-аспартил-L-фенилаланина. Чистота 003; выход 88,63.

D-Phe-Ме не реагирует с N-Z-L-Asp, в реакции с протеазой связывается с дипептидом и осаждается как аддитивное, соединение.

0,534 г (2 ммоль) N-бензилоксикар" бонил-Ь-аспарагиновой кислоты и

0,863 г (4 ммоль) хлоргидрата метилового эфира DL-фенилаланина растворяют в 10 мп воды, рН раствора доводят до 6,0 с помощью 7ь-ной аммиачной во- р ды. К раствору добавляют с 50 мг термолизийа и смесь встряхивают в течение ночи при 38-40 С. Осадок отфильтровывают, промывают 10 мл воды и сушат, получают 0,90 r кристаллического зо продукта. T. пл. 120-126 С. После перекристаллизации из смеси этилацетата и н"гексана, получают продукт с т.пл.

128-134 С и Г4.) = - 6,3 (С = 1, меD танол). Инфракрасный .спектр и спектр

ЯИР продукта идентичны спектрам присоединения метилового эфира N-бензи локсикарбонил-Ь-аспартил-L-фенилаланина и метилового эфира L-фенилаланина (1:1).

Найдено, 4: С 63,42; H 6, l7; N6,95

Ся. Hgr Лаз

Рассчитано, 4: С 63,24; Н 6,13;

N 6,97.

Продукт обрабатывают кислотой, nogs лучают метиловый эфир N-бензилоксикарбонил-L-аспартил-Ь-фенилаланина и метиловый эфир D-фенилапанина .в мольном отношении 1:1. Из полученных результатов сделан вывод, что соедине" ние есть продукт присоединения метиso лового эфира N-бензилоксикарбонил-Е-аспартил-L-фенилаланина и метилового эфира D-фенилаланина (1: 1).

Смесь 0,50 г (0,82 ммоль) продукта присоединения с 4 мл воды и 0,26 r лимонной кислоты перемешивают при комнатной температуре в течение .l0 мин и обрабатывают в условиях при Пример 24. 0,47 r (0,82 ммоль) ледяной уксусной кислоты и 8 мл воды помещают в 30 мл колбу, 0,50 г (0,82 ммоль) продукта присоединения метилового эфира N-бензилоксикарбонил-Ь-аспартил-L-фенилаПанина и метилового эфира Е-фенилаланина, смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 10 мин, продукт отфильтровывают, промывают 10 мл во-. ды, сушат, получают 0,308 г белых кристаллов метилового эфира N-бензи-!.

19 9 l011 локсикарбонил-L-аспартил-L-фенилаланина. Чистота 1003, выход 87 23.

Пример 25. 1,00 г (1,65 ммоль) продукта присоединения метилового эфира N-бензилоксикарбонил-Ьсаспартил-Ь-фенилаланина и метилового эфира Ь-фенилаланина, полученного в примере .19, загружают в

30 мл колЬУ, добавляют 2 мл воды и

2,0 мл 1 н.НС1, смесь перемешивают io при 60 С в течение 3 мин, затем обраЬатывают способом, описанным аналогичным в примеру t9, получают

0,35 r кристаллов метилового эфира

N-оензилоксикарбонил"L-аспартил"L- is

-фенилаланин. Чистота 1004; выход

1 ЮО .

П р и и е р 26. 0,594 r (2 ммоль)

N-P-метоксиоензилоксикарбонил-L-аспарагиновой кислоты и 0,860 г (4 ммоль))2о хлоргидрата метилового эфира Ь-фенилаланина растворяют в 1 н.NaOH, значение рН доводят до 6,0. Полученный раствор смешивают с 50 мг термолизина, встряхивают в течение ночи 2S

38-40 С. Осадок отфильтровывают, промывают 10 мл воды, сушат, полу" чают 0,928 r кристаллов, имеющих 687 îc

Результаты подтверждают получение зв продукта присоединения метилового эфира N-P-метоксибензялоксикарбонил"L-аспартил-L-фенилаланина и метило-вого эфира L- фенилаланина (1: 1).

После перекристаллизации продукта из смеси этилацетата и н-гексана.

Т,пл. 72-76 С. (31 = + 6,5 (С = 1, метанол).

Найдено, 1: С 61,85; Н 6,04; N6,46

СмНм Ф о - о

Рассчитано, : С 62,15, Н 6,16; и 6,5.9.

Инфракрасный спектр: 3280 см - ..(колебание растяжения связи N-Н);

3020 и 2930 см 1 (колебание растяжения С-H); 1735 см (сложный эфир

С 0); 1700 см (С = О уретан); (2-ое амидное поглощение); 1435 см .(С-.Н деформационное колебание);

l380 см " jêàðáîêñèëàò); 1210 до

1?40 см- (колебание растяжения связи

C-О-С и 3-е амидное поглощение);

1030 см (колебание фенила в плоскости). и 690, 740 и 810 см колебание фенила вне плоскости).

Спектр ЯМР, 8 : (1) 2,7 ppm (2Н); (2) 3, 1 ppm (4Н); (3) 3,6, ррп (ЗН);

3, 7 ppm (ЗН); (4) 3, 8 р (ЗН); (5)

4,0 ppm (1н); (6) 4 5 ppm (1Н) (7) 7 20

4,8 ppm (1H); (8) 5,0ppm,(2Н); (9)

5,65 ppm (ЗН); (10) 5,65 ррп (1H); (11)

Ь,2 "(1Н); и (12) 6,8 до 7, 3 ppm (14Н).

Полученные результаты показывают, что продукт является продуктом присоединения формулы I, где Rq Rz, Йъ, и и означают и-метоксибензилоксикарбонил, бензил, метокси и 1 соответственно.

Смесь 0,500 г (0,78 ммоль) продукта присоединения метилового эфира N-P-метоксибензилоксикарбонил-L-аспар- тил-L-фенилаланина и метилового эфира

Ь-фенилаланина, полученного таким образом, с 2 мл воды и 0,94 мл . (0,94 ммоль) 1 í.HCR перемешивают при

60 С в течение 3 мин. Полученную суспензию отфильтровывают и промывают

6 мл воды, сушат, получают 0,32 г кристаллов.

Нижеследующие результаты подверждают, что продукт является сложным эфиром Ы-P-метокси-бензилоксикарбонил-L-аспартил-L-фенилаланина. Чистота 100 выход 89,11.

Кристаллы растворяют в этилацетате. и продукт осаждают н-гексаном получают соединение с т. пл. 128-130 С, ("-10 = - 15,1 (С = l метанол)

Найдено, 4: С 60,30; Н 5,74; N 5,99

С ь 4е М в

Рассчитано, /: С 60,25; Н 5,72;

М 6,11.

Инфракрасный спектр: 3280 см (растяжение N-H); 2930 и 3020 см (колебание растяжения С-Н); 1735 см (С = О сложный эфир); 1700 см " (С=0 уретан); 1650 см (1-ое амидное поглощение); 1510 до 1540 см (2-е амидное поглощение); 1440 см " (дефор.мация С-Н); 1220 до 1270 см (колебание растяжения С-О-С, 3-е амидное поглощение); 1030 и 1050 см "(колебание фенила в плоскости); 690 и 810 см (колебание фенила вне плоскости).

ЯИР спектр, 8 : (1) 2,8 рртй (2Н); (2) 3,0 ppm (2Н) (j) 3,6 реп (ЗН); (4) 3,8 ppm (ЗН) (5) 4 5 ppm (1H) (6) 4,8 pgm (1H) (7) 6,6 ррп (2Н); (8)

6,0 ppm (1Н) (9) 6,6ppm (1Н); (10)

6,6 ppm (1H) (11) 6,8 до 7,3 ppm (9Н).

Эти результаты показывают, что конечным продуктом является соединение формулы IV, в котором Й, R, R> и и означает и-метоксибензилоксикарбонил, бензил, метокси и 1 соответственно.

21 9101

0,2 весовых частей полученного ме- тилового эфира N-P-метоксибензилокси-карбонил-1,-аспаргил-l.-фенилаланина растворяют в 2 вес.ч. ацетона и к полученному раствору добавляют

1 вес.ч. 4 н.НС, смесь нагревают на водяной бане со слабым противотоком в течение 1,5 ч, до полного разложения для образования раствора, содержащего в качестве. основных компонентов метиловый сложный эфир L-аспартил-L-фенилаланина, метиловый эфир L-фенилаланина и анисовый спирт, причем из указанного раствора получают метиловый эфир 1.-аспартил-1.-фенилаланина 1

Пример 27. 0,562 г (2 ммоль)

N áåíçилоксикарбонил-!. вЂ” глутаминовой кислоты и 0,860 r (4 ммоль) хлоргидрата метилового эфира «,-фенилаланина растворяют в 1 н.Nao«-«, и.рН доводят до 6,0.

Полученный раствор смешивают с

50 мг термолизина и смесь встряхивают при 38-40 С в течение ночи. Осадок отфильтровывают, промывают 10 мл воды, сушат, получают 0,510 r кристаллов, т. пл. 80-.85 С.

Следующие результаты подтверждают, что получили продукт присоединения метилового эфира N-бензилоксикарбонил-1-глутамил-1.-фенилаланина и метилового эфира L-фанилаланина (1:1).

Продукт перекристаллизовывают из смеси этилацетата и í-гексана т. пл.

92-97 С. Eh.) 0 = О, 1 (С = 1, метанол)

Найдено, i: С 63,61; H 6,31; N 6,65 Ъ««N "«.Ф9

Рассчитано, б: С 63,75; Н 6,32;

N 6,76.

Инфракрасный спектр: 3340 см (колебание растяжения связи N-Щ;

2950 и 3030 см (колебание растяжения связи С-Н); 1730 и 1745 см (С = 0 сложный эфир); 1690 см= (С = 0 уретан); 1660 см (1-ое амидное погло45 щение); 1620 см (карбоксилат);

1530 см "(2-ое амидное поглощение);

1440 см " (С-Н деформационное колебание); 1405 см " (карбоксилат); 1240 до «310 ам (С-0-С колебание растяже50 ние и 3-е амидное поглощение);

1050 см (колебание фенила в плоскости); 700 и 750 см (колебание Фени. ла вне плоскости).

Спектр ЯМР, 8 : (l) 2,0 ppm 2Н); (2) 2,3 ppm «2H); (3) 3,0 ppm (4Н); (4) 3,6 ррп (3Н) и 3,7 реп 3H); (5)

3,8 ppm (.1H) (6) 4,3 ppm (1H) (7)

14ô,8 ppm (.1Н)1 (8) 5,0 Ppm «2Н); (9) 17 22

5,8 ppm (3Н); (10) 5,8 ртяп (1Н); (11)

7,2 ppm (1H); (12) .7,2 ppm (10Н); (1,3) 7 3 ppm (5Н) .

Эти результаты показывают, что продукт является присоединением формулы 1, где Rq R, R и и означают бензилоксикарбонил, бензил, метокси и 2 соответственно.

0,100 г продукта присоединения метилового эфира И-бензилоксикарбонил-L-глутамил-L-фенилаланина и метилового эфира L-фенилаланина добавляют при перемешивании 2,3 мл (0,32 ммоль) 0,14 и НСГ, и смесь затем перемешивают при комнатной температуре в течение 15 мин. Полученный белый осадок отфильтровывают и промывают 3 мл воды, сушат, получают 0,0683 г кристаллов.

Следующие результаты подверждают, что пр

Способ получения продукта присоединения дипептидного производного и аминокислоты

Патент 910117