Способ определения транспорта ионов калия грамотрицательными бактериями

Способ определения транспорта ионов калия грамотрицательными бактериями

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

ОП ИСАНИЕ

ИЗОВРЕТЕН ИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

< И2752

Союз Советсиик

Социвлистичвсиии ресттублии (61) Дополнительное и авт. свнд-ву (22) Заявлено 06. 05. 80 (21) 2949267/28-13

{5! )М. Кл. с присоединением заявки .% (23) Приоритет

С 12 К 1/00

31твударстиинм6 квинтет

СССР ав делам имбретеиий и еткритиВ

Опубликовано 15.03.82. Бюллетень № 10

{53) УДК664 921.. .2(088 .8) Дата опубликования описания 15 . 03 . 82 (72) Авторы изобретения

Е,О. Пучков и В.А. Пинчукова.Всесоюзный научно-исследовательский институ микробиологии (71) Заявитель (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТРАНСПОРТА ИОНОВ КАЛИЯ

ГРАИОТРИЦАТЕЛЬНЫИИ БАКТЕРИЯМИ3 . Изобретение относится к медицине, и частности к микробиологии, и может быть использовано для оценки физиологического состояния грамотрица" тельных бактерий в микробиологичес-. кой промышленности, а также в биохимических, микробиологических и биофизических исследованиях.

Известен способ, определения транспорта ионов калия грамотрицательны ми бактериями с использованием ионоселективных электродов 1).

Однако известный способ не позволяет точно определить транспорт ионов калия.

Целью изобретения является повы-. шение точности способа.

Указанная цель достигается тем, что суспензию бактерий вносят в раствор сахарозы или маннита в концентрации 250-500 мИ, затем вводят раствор хлорида калия в концентрации

1,0- 10,0 мМ, и определяют транспорт ионов калия регистрацией изменения светорассеяния суспензии во времени.

Способ осуществляют следующим образом.

Гомогенную суспензию отмытых в дистиллированной воде бактерий в концентрации 10 -10 кл/мл помещают в, В оптическую кювету, содержащую раствор сахарозы или маннита (250-500 мИ).

Через 1-2 мин регистрируют изменения светорассеяния суспензии бактерий при . свете с длиной волны 500-600 нм. Затем в кювету вносят хлористый калий до конечной концентрации О, 1- 10 мИ и регистрируют уменьшение светорас-

1 сеяния во времени. Динамика изменений светорассеяния при этом однозначно отражает накопление бактериями ионов калия. Измерения изменений светорассеяния бактериальной суспензии

20 проводят на флуориметре, спектрофо" тометре или фотоэлектрокалориметре по точкам или с использованием реги. стрирующего самописца.

912752

° 3

На чертеже показана зависимость интенсивности светорассеяния суспензии бактерий от времени.

Пример 1. Эксперимент проводится на Esherichia Cori и Pseudomonas aeruginosa.

Результаты, полученные на обоих представителях грамотрицательных бак. терий, одинаковы.

В оптическую кювету помещают раст- 10 вор 250 мМ сахарозы, к которому до" бавляют дважды отмытые в дистиллированной воде и ресуспендированные в воде до гомогенности клетки бактерий до конечной концентрации 5 ° 10 кл/мл.,1$

Кювету помещают в флуориметр и реги" трируют светорассеяние при 600 нм под углом 90О. К суспензии добавляют хлористый калий до конечной концентрации 10 мМ, перемешивают в тече- 20 ние 3-5 с и регистрируют уменьшение светорассеяния клеточной суспензии во времени. На чертеже показан харак гер получаемой зависимости светорассеяния от времени (стрелкой показан 5 момент добавки KC9). Зарегистрированное уменьшение светорассеяния сус. пензии бактерий в указанных условиях однозначно отражает энергозависимое накопление ионов калия клетками. Ионы натрия до концентрации 50 мМ не сказываются на регистрируемой реакции.

Тождественные результаты получаются при регистрации изменений оптичес. кой плотности суспензии.бактерий.

Пример 2. Берут бактерии

Е.СоИ, дважды отмытые в дистиллированной воде, и готЬвят из них гомогенную водную суспензию с концентрацией клеток 10 кл/мл. Суспензию деg лят на три порции.: две опытных и од-: ну контрольную. Первую опытную пробу объемом 0,5 мл замораживают в стеклянной пробирке до - 19ФС путем быстрого погружения пробирки в жидкий азот, где ее выдерживают 5-10 мин.

После этого пробирку вынимают из жидкого азота и размораживают при комнатной температуре. Вторую опытную пробу объемом 0,5 мл замораживают до

- 78 C на сухом льду и лиофилизируют, После лиофилизации регидратируют добавкой 0,5 мл дистиллированной воды. Контрольный образец хранится все время при кЬмнатной температуре без каких-либо обработок. Во всех трех образцах регистрируют калий-транспортирующую активность предлагаемым способом. ф

В табл. 1 представлено изменение параметров калий - транспортирующей активности бактерий Е. Cori после ниэкотемпературного замораживания и лиофилизации.

Из данных табл. 1 следует, что как замораживание,так и лиофилизация отрицательно сказываются на калийтранспортирующей активности бактерий °

Причем после замораживания практичес ки все клетки в популяции сохраняют способность накапливать ионы калия (параметр Н не изменяется), хотя и с меньшей скоростью, по сравнению с контролем (параметр 1/2 увеличивается). После лиофилизации клеток,спо" собных накапливать ионы калия, в по. пуляции уменьшается (параметр Н уменьшился), но у остальных клеток калий"транспортирующая активность изменяется меньше, .чем после эамора. живания.

Пример 3. Берут бактерииЕ.Со31, дважды отмытые в дистиллиро" ванной воде, и готовят из них гомо" генную водную суспенэию с концентрацией клеток 10 кл/мл. Суспензию делят на четыре порции: три опытных и одну контрольную. B первую опытную пробу вносят грамицидины Д до кон" центрации 20 мкг/мл. Во вторую опытную пробу вносят этилендиаминтетраацетат натрия (ЭДТА) до концентрации 0,1 мМ. В третью опытную пробу вносят ЭДТА до концентрации 0,1 мМ и грамицидин Д до концентрации

20 мкг/мл. В контрольный образец добавок не делают,. Во всех образцах измеряют калий-транспортирующую активность предлагаемым способом.

В табл. 2 представлено изменение параметров калий-транспортирующей активности E.ÑoÈ после обработки грамицидином Д.

Из данных табл. 2 следует, что после обработки бактерий Е.СоВ1 грамицидином Д в присутствии ЗДТА практически все клетки утрачивают способнрсть накапливать ионы калия из-эа повышенной проницаемости для одновалентных ионов у цитоплазматических мембран, которую индуцируют антибио;. тик, Без ЭДТА мембраны Е.СоИ не чувствительны к данной концентрации антибиотика.

Предлагаемый способ позволяет по" высить точность определения транспор та ионов калия и может быть исполь" эован для характеристики физиологи5 912752 6 ческого -статуса популяции бактерий, щих приемов (замораживания, лиофилиа также целостности их мембран, на- зации) антибиотиков мембранного дейпример, после действия консервирую- ствия.

1 блица 1

Параметры

Контроль Заморажи- Лиофилизавание . ция з» ,ми н

Н, от н . ед .

10

Таблица 2

Грамицидин Д

ЭДТА Грамицидин

Д + ЭДТА

Параметры

Контроль й,1, мин

Н, отн.ед.

12

Форйула изобретения

2$

Способ определения транспорта ио" нов калия грамотрицательннми бактериями, отличающийся тем, что, с целью повышения точности способа, суспензию бактерий вносят в раствор сахаровы или маннита в кон,30 центрации 250-500 мМ, затем вводят

I раствор хлорида калия в концентрации

1,0- 10,0 мМ и определяют транспорт ионов калия регистрацией изменения светорассеяния суспензии во времени.

Источники информации,. принятые во внимание при экспертизе

1.Durgarian S S., Nartirosov S Ì.

"Вioegectrochem. Вioenergetics". 1978, 3, 554.

912752

ЮГ

Составитель P. Катосова

Редактор И.Митровка Техред Е. Харитончик, Корректор С. Шекмар

« «»«

Заказ 1316/35 Тираж 505 . Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5 .Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4