Штамм еsснеriснiа coli в 834 ( @ @ )/pbr 322

Штамм еsснеriснiа coli в 834 ( @ @ )/pbr 322

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

1,> 1,Ф (Инсти;гут би жимии и физиологии микроорганизм% ., * -" /

АН СССР (7l ) Заявитель (54) ШТАММ Е SCHERICHIA. QLl

В 834-(3 veв-) Р BR 32Х

Изобретение относится к микробиологической промышленности и.-.представляет собой штамм ЪсИемсФис со, -несу щий плазмиду, используемую как тесъ" субстрат для определения активности фермента при выделении и очистке ресьрвщисжной эндануклеазы ЕсоВЙ,, которая . используется в молекулярной биологии.i генной инженерии.

Рестрикционные эндонуклеазы стали мстим инструментом при создании рекомбиначных ЙНК М v14wo а также.для изучения первичной структуры и фи зического картирования lLHK. Поэтому

ripavpecc в молекулярной биологии и res ной инженерии обусловлен прогрессом в области изучения и выделения ферментоврестрикционных эндонуклеаз, Среди этих рестрикционных эндоиук- леаз, особое место занимает эндонукле..аза ЕСо Кф, которая узнает последова-, тельносзь 5 UU ГГ Э 1) .

Эта рестрикционная эндонуклеаза была открйта и описана с помошью ме2 тода цен рифугирования фрагментов изотопномеченной фаговой llHK в градиенте концентрации сахарозы при определении активности фермента 2) .

Этот метод предполагает. испопьзова» ние в качестве тесъ-субстрата меченный

QHK фага лямба, но процесс получения и испопьзования этого тестмфбсчрата следует считать очень трудоемким и весьма неудобным.

В последнее время дпя тестирования реатриктаз наиболее широко испопьзуе вся метод элекчрофореза в попиакриламид» ных и агарозных гелях. В качестве стан

- дартных тест-субстратов в этом случае используют ЙНК фага лямбда, GHK адвновируса 2 и вируса 5Ч40. После гидрюлиза рестриктазой фрагменты RK фракцисн руют в геле, после элекчрофоретическаго разделения гель окрашивают бромистым этидием и фрагменты llHK визуализиру ются при УФ освешении геля З).

Но рестриктаза Всо М - это мелкощепящая эндонуклеаза, INK фата лямбда

3 " 9183 она расщепляет более чем на 35 фрат ментов (a то время как другая широко используемая рестриктаза Eco RI на 6

: фрагментов) g4) .

Таким образом, при выделении и очист-у ке ECo Ю1 практически невозможно оценить активность электрофорезом при использовании QHK фага лямбда. Множество фрагментов, образующихся при гилро-. лизе ДНК фага лямбда рестиктазой 1 соМ, 10 не дают ясной картины о степени гидролиза QHK.

Для определения активности Eco RtT требуется ДНК-субстрат с небольшим моле33 кулярным весом, на роль такой QHK мо гут подойти QHK плазмид.

Такймй ДНК-субстратами могут быть

QHK амплифйцируемых, дающих множество копий QHK на клетку, плазмид, напри мер, хорошо Известная плазмида Рйй

322, мол. вес 2,8 мегадальтон g5g;, Но этим плазмйдные ДНК находятся

> штаммах Е. cofq К, которые имеют специфический фермент QHK-цитозин ме2$ тйлазу. Фермент.ме телирует цитозин в

ДНК и делает ДНК плаэмид устойчивым к действию рестрикционной эндонуклеазы Есо R1I» $6), Поэтому плазмиды, находящиеся в этих штаммах не могут слу»

0 30 жить субстратом для Йсо Щ.- Для этих целей пригодны ДНК, если она выделены из штамма не содержащего QHK-цитоэин метилазу.

Ueab изобретения - штамм Е.CO5, содержащий плазмиду Р Щ 322, которая может быть использована для тиристирования активности рестракционной эндо нуклеазы ЕСо К11.

Штамм получен путем чрансформации плаэмйды РВИ 322 в штамм Е.Соб В834, который не содержит.QHK-цйтозйн метила „. зу.

Предлагаемый штамм характерйзуется следующими признаками, Морфологические признаки. Клетки прямые, палочковидной формы, 1,1-1,5>

%2,0-6,0 мк, подвижные с перефихиальными жгутикамй, грамотрйцательные . и неспороносные.

Культурные признаки. Хорошо растут . Зп на простых питательных средах. При рооте на мясо-пептонном агаре,. питательном агаре Йифко, минимальном агаре Дэвиса с глюкозой и казаминовыми кислотами - колонии гладкие, круглые, прижа-, тые, блестящие, серые, край ровньш, мутные (на синтетических средах - более слизистые и мучные). При росте в жид04 4 кйх средах мясонептанный бульон бульон «Дйфко, минимальная среда М9) с .глюкозой и казаминовыми кислотами образуют ровную, интенсивную муть,. / Физиолого-.биохимические,признаки.

Растет в пределах.от 4 до 45 С при оптимум рН 6,8-7,5.

В качестве источника углерода используют многие углеводы, спирты, органичеокие кислоты, в частности: о -глюкозу, Д-фруктоэу, сахарозу, арабйнозу, ксилоэу, лактозу, чрегалозу. Не усваивает ацетат, аданит, галактозу. В средах с глюкозой активно подкисляет с образова нием газа.

В качестве источника азота использу ет как минеральные соли в аммонийной и нитратной форме, так и в органической, s виде пептона, аминокислот. Нитраты восстанавливает до нитрияов.

Желатину не разжижает.

Появляется устойчивость к антибиотй -.1 кам: тетрациклину (30 мгlмл), ампициллину (25 мгlмл).

Пример 1. Выделение плазмидной QHK.

Клетки, содержащие плазмиду выращивают в 500 мл бульона до плотности

0,6/5 10 клеток на 1 мл. Затем клетВ ки собирают центрифугированием (5000 об/мин., 20 мин), суспендируют в 4 мл

25%-ной сахаровы.в 50 мл трис-НС8, :рН 0,8, добавляют 1,2 мл лизоцима (10 мг/мл) и йнкубируют 10 мин; во льду дри перемешивании. К смеси добав-ляют 2,4 мл 0,25 М .ЭДТА (рН 0,8), оставляют во льду на 10 мин, а затем добавлякл последовательно 2,6 мл 5М р-ра КАСС и 1,2 мл 10%-ного р-ра додецилсульфата натрия, инкубируют во льду в течение 5-7 ч. Осветленные лизаты получают центрифугированием смеси

16000 в: течение 1-ч. К экстрактам добавляют С С6 из расчета 0,94 г на

1 мл и бромид этидия до конечной концентрации 200 мг/мл. Полученную смесь центрифугируют при 44000 об/мин, в течение 40 ч в роторе Tq 50. Нижнюю, прокрашенную бвомистым этидием, зону собирают по каплям, прокалывают пробирку под зоной. Бромид этидия удаляют 2-х кратной экстракцией изопропиловым спиртом. Полученную QHK диализуют против

10 мм трис-НСВ, рН 7, 5, 20 мМ, ПОСВ, 1 мМ ЭДТА.

Пример 2; Трансформация паевмидной ДНК.

Составитель Т. Тулякова

Техред А.Бабинец Корректор Н. Стец

Реп»кттр Н. Квнтултнел

Заказ 2055/1 . Тираж 505 Подписное.

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва .Ж-35, Раушская:наб., a. 4/5

Филиал ППП Патент", г. Ужгород, ул. Проекжая, 4

5 91 В 100 мл бульона вносят 1 мл куль туры Е.СОб в 834 и выращивают по плотности 0,4. После охлаждения клеток собирают пентрифугированием и ресуспендируют в равном объеме 10 мМ NclCC ., После 20 мин инкубации во льду клетки собирают центрифугированием и ресуспенцируют в 1/2 объема 75 мМ Сс С

Клетки инкубируют 20 мин и вновь собирают центрифугированием. Осадок ра суспедируют в 1 мл .75 мМ CQCKg

К 0,2 мл еуспензии полученных клепах добавляют 0,1 мл ЙНК плазмиды

pBR 322, инкубируют во льду 20 мин.

Затем смесь подвергают 2х минутной обработке при 42 С и выдерживают 15 мин при 24 С. Смесь разбавляют в 10 раз бульоном, подрашивают клетки 30 мин при 37 С и отбирают по 0,1 мл суспензии и высеивают на чашки с питательным агаром, содержащие 25 мг/мл ампи циллина

Пример 3. Определение активноон ти рестрикционной эндонуклеазы Eco LI.

К 1 .мг ЙНК в буфере, содержащем .

50 мМ тряс рН 7,5 10 мМ !AgCtg, 10 мМ 2-меркаптоэтаноп, l мМ ЭЙТА, добавляют от 0,1 до 5 мл эндонуклеазы

Есо КП, общий объем смеси 40 мл, Гидролиз ведут при 37 С 15 мин. Полученные фрагменты ЙНК анализируют с .помощью элекчрофореза в 1%-ном агарозном пластинчатом rene в трис-ацетатном буфере (pH 8,0).

8304 6

Предложенный штамм, плазмипа из которого используется в качестве тест-субстрата для рестрикционной эндснуклеазы . Eco Щ,позволяет получать тест-суб 1 страт, который может быть использован для определения и оценки активности фермента как очищенного, так в грубых экстрактах.

1р

Формула изобретения

Штамм КСЬЕГЧСЫа CORI В 834 (Fg йч )/Pgk 322, Ж ВКМ В15 14417) (хранится во Всесоюзной коллекции микроорганизмов при институте био химии и физиологии микроорганизмов

АН СССР), используемый в качестве тест-субстрата для рестрикционной эндо щ нуклеазы Есо КИ.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

»

ы 1.В1 ег сй.е аЕ.Nature Нее 94îá ç.

1973, 244,7-10.

2.Зов)рО6 КМ.,Р5Л)-ТВЕРЬ, (9 И,ОИ Ч. о Ga4 o ó a.

3.М сИф Р-А. ЕА at. îcÜåþ üÜ . ур 1973, Ч,12. 3055.

4.Roberts R 3. Ст t Res В1осйе л., 1976 Ч. 4, 133.

5. собра F. et ас.. Qe@6 1917, Y.2,96-щ;

6, "Биохимия, 1978, т. 43, 1718.