Способ определения ферментативной активности моноглицеридлипазы

Патент 918853

Авторы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОП ИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Союз Советских

Социалистических

Республик

2 ц918853 (61) Дополнительное к авт. свнд-ву (22) Заявлено 160580 (21) 2949312/30-15 (5l)N. Кд.

G 01 N 33/48

С 12 Q 1/34 с присоединением заявки М тоаударстаоаие квинтет

CCCP аа делан.: азебретеяий и аткрытнй (23)ПриоритетОпубликовано 070432. Бюллетень J413

Дата опубликования описания 070482 (53) УДК616=074:

:577.153.08 (088.8}

И.Я.Иедкова, К.В.Смирнов и Б.П.Суринов

1 1, -,.

Научно-исследовательский институт медиц ской

1 радиологии АИН СССР и Институт медико-биологических " проблем вЂ” вЂ” », (72) Авторы изобретения (7l ) Заявители (54} СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФЕРИЕНТАТИВНОЙ

АКТИВНОСТИ ИОНОГЛИЦЕРИДЛИПАЗЫ

Изобретение относится к области анализа ферментных реакций и может быть использовано при определении активности моноглицеридлипазы в биологических средах, в частности для диагностики заболеваний кишечника, когда меняется активность этого фермента в слизистой оболочке кишечника, его содержимом и кале, и в научно-исследовательских лабораториях . при экспериментах на животных.

Известен способ определения ферментативной активности моноглицеридд» липазы (моноглицеридгидролаэа} а слизистой оболочке тонкого кишечника, включающий приготовление пробы; ферментативный гидролиз липидного субстрата под действием ферментов испытуемой пробы, экстракцию жирных кислот, освободившихся при гидролизе, зт и определение ферментативной актив-. ности моноглицеридлипазы по количеству освободившихся s единицу времени жирных кислот титрованием щелочью. !

Величину активности моноглицеридлипазы рассчитывают, исходя из количества освободившейся в единицу вре" мени олеиновой кислоты (lj.

Недостатками данного способа определения активности моноглицеридлипазы является его ниэкая чувствительность и точность, сложность технологии анализа, .а также невозможность определять активность в содержимом кишечника и кале, Низкая чувствительность обусловлена тем, что для проведения анализа требуются большие количества ткани кйшечника (целые его сегменты до 1-2 r массой) и необходимостью выделять иэ клеток мик росомальную фракцию. Низкая точность обусловлена невозможностью получить стандартную эмульсию субстрата, не" обходимостью удалять из кишечника отмыванием панкреатическую липазу, способную гидролизировать эмульсии липидов, что приводит к частичной потере и моноглицеридлипазы, исполь3 9188 зованием титрометрического определения освободившейся жирной кислоты, что,вносит дополнительную ошибку за счет субъективности определения окончания титрования.

Технологическая сложность анализа данным способом вызвана необходимостью лабораторного синтеза моноолеина, его последующего эмульгирования, выделения микросомальной фракции. Невозможность применять данный способ для определения ферментативной активности моноглицеридлипазы в содержимом кишечника и кале связана с высоКим содержанием в них панкреатической липазы, которую нельзя удалить, но которая гидролизует эмульсии липидов (в данном случае моноолеин) .

Ошибка данного способа 10-124, а время, необходимое для выполнения анализа 10 проб - 5-6 чел.-ч.

Цель изобретения вЂ” повышения чувствигельности и точности способа, а также упрощение процедуры анализа и достижение возможности определять ферментативную активность моноглицеридлипазы в содержимом кишечника и кале.

Эта цель достигается тем, что в качестве субстрата используют водный раствор диоксиэтиленсорбитанмонолаурата в концентрации 70- 75 мг/мл в трис-буфере с рН 7,5-8,5.. После его инкубирования с испытуемой пробой определяют количество освободив35 шейся лауриновой кислоты путем фотоколориметрического определения окрашенного комплекса лаурата меди с хромогенным комплексообразователем.

Аксивность моноглицеридлипазы рас<е считывают по количеству освободившейся лауриновой кислоты s единицу времени на единицу массы ткани кишечника или кала.

Пример l. (концентрация субстрата 70 мг/мл трис-буфера рН

7,5), 0,1 мл испытуемой пробы (экстракт 50 мг слизистой оболочки тонкого кишечника крысы в 1О мл воды) смешивали с 1 мл раствора диоксиэти- . ленсорбитанмонолаурата (концентрация

70 мгlмл) в трис-буфере с рН 7,0, инкубировали 10 мин при 37 С,добавляли 7 мл смеси хлороформа с гептаном (в соотношении 3:2), встряхивали

4-5 мин, добавляли 3,5 мл медного реактива (5 мл М уксусной кислоты, 7,6 мл триэтаноламина, 2,38 г азотнокислой меди, 60 мл воды, рН 8,3), 53 4 встряхивали 0,5 мин, из верхней фазы отбирали 3 мл и добавляли 0,5 мл хромогенного комплексообразователя (диэтилдитиокарбамат 1 мг/мл в смеси н-бутанола и хлороформа в соотношении 3:2), окрашенный раствор фотоколориметрировали при 435 нм. Определяли количество лауриновой кислоты, освободившейся при ферментативном гидролизе субстрата, по калибровочной кривой.

Контрольная проба. Испытуемую пробу добавляли после 10 мин инкубировао ния при 37 субстратного раствора и добавление 7 мл смеси хлороформа с гептаном. Активность выражали в мкмоль лауриновой кислоты, освободившейся при фрементативном гидролизе субстрата в мин на 1 г слизистой оболочки тонкого кишечника. РезультатвЂ”

35,8 мкмоль/мин.г.

Пример 2.(концентрация субстрата 72,5 мг/мл в трис-буфере рН

8,0), 0,1 мл испытуемой пробы (экстракт 50 мг слизистой оболочки кишечника в 10 мл воды) смешивали в

1 мл раствора диоксиэтиленсорбитанмонолаурата (концентрация 72,5 мг/мг в трис-буфере с рН 8,0, инкубировали 10 мин ври 37 С,добавляли 7 мл смеси хлороформа с гептаном (в соотношении 3:2), встряхивали 4-5 мин, добавляли 3,5 мл медного реактива (5 мл уксусной кислоты, 7,6 мл триэтаноламина, 2,38 r азотнокислой меди, 60 мл воды, рН 8,3) встряхивали

0,5 мин, из верхней фазы отбирали

3 мл и добавляли 0,5 мл хромогенного комплексообразователя .(диэтилдитиокарбамат 1 мг/мл смеси н-бутанола и хлороформа в соотношении 3:2), окрашенный раствор фотоколориметрировали при 435 нм. Активность моноглицеридлипазы рассчитывали по количеству освободившейся при ферментативном гидролизе субстрата лауриновой кислоты, определяемого по калибровочной кривой.

Контрольная проба. Испытуемую пробу добавляли после 10 мин инкубирования субстратного раствора при о

37 С и добавления 7 мл смеси хлороформа с гептаном. Активность выражали в мкмоль освободившейся лауриновой кислоты -.в мин на 1 г слизистой оболочки тонкого кишечника. Результат - 38,1 мкмоль/мин.r.

П р и м е. р 3. (концентрация субстрата 75 мгlмл в трис-буфере

91885

Формула изобретения,ВНИИПИ Заказ 2129/27 Тираж 083 Подписное

Филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул. Проектная, 4

5 рН 8,5), 0,1 мл испытуемой пробы (экстракт 50 мг слизистой оболочки тонкого кишечника крысы в 10 мл воды) смешивали с 1 мл раствора диоксиэтиленсорбитанмонолаурата (концент5 рация 75 мл/мл) в трис-буфере рН

8,5, инкубировали 10 мин при 37 С, добавляли 7 мл смеси хлороформа с гептаном (в соотношении 3:2), встряхивали 4-5 мин, добавляли 3,5 мл мед- щ ного реактива (5 мл уксусной кислоты, 7,6 мл триэтаноламина, 2,38 r

- азотнокислой меди, 60 мл воды, рН

8,3), встряхивали 0,5 мин, из верхней фазы отбирали 3 мл и добавляли

0,5 мл хромогенного комплексообразователя (диэтилдитиокарбамата 1 мг/мл смеси н-бутанола и хлороформа в со" отношении 3:2), окрашенный раствор фотоколориметрировали при 435 нм.

Активность моноглицеридлипазы рассчитывали по количеству освободившейся при ферментативном гидролизе субстрата лауриновой кислоты, определяемого по калибровочной кривой.

Контрольная проба. Испытуемую пробу добавляли после инкубации субстратного раствора 10 мин при 37 С и добавления смеси хлороформа .с гептаном ° Активность выражали в мкмоль ос- зр вободившейся лауриновой кислоты в мин на 1 г слизистой оболочки тонкого кишечника. Результат

37,6 MKMOllb/ìèí. г °

Предложенный способ определения ферментативной активности моногли35 церидлипазы имеет высокую чувствитель. ность (в 50 раэ выше, чем в известном способе по количеству требующейся для анализа ткани), а также и по минимальной определяемой активности фермента. Это позволяет определять активность моноглицеридлипазы в малых образцах проб, а также в кале.

В предлагаемом способе отсутствует гидролиз используемого субстрата панкреатической липазой. Это свидетельствует о его точности (специфичности) вЂ” присутствие панкреатической

3 6 липазы в испытуемых объектах не искажает результаты анализа. Ошибка способа 5-6 .

Предлагаемый способ обладает технологической простотой и в 2-3 раза более высокой производительностью, чем известный способ.

Для проведения анализа 20 проб требуется 3 чел.-ч.

Способ определения ферментативной активности моноглицеридлипазы (в кале, содержимом кишечника, биопсийных образцах слизистой оболочки кишечника)может быть применен для клинико-диагностических лабора", торий при диагностике заболеваний желудочно-кишечного тракта (ферментативная недостаточность, воспалительные процессы и др.).

Способ определения ферментативной активности моноглицеридлипазы, включающий приготовление пробы,ферментативный гидролиз липидного субстрата под действием ферментов испытуемой пробы, экстракцию жирных кислот, освободившихся при гидролизе, и определение ферментативной активности моноглицеридлипазы по количеству освободившихся в единицу времени жирных кислот, о т л ивЂ” ч а ю шийся тем, что, с целью повышения чувствительности и точности определения и упрощения способа, в качестве субстрата используют раствор диоксиэтиленсорбитанмонолаурата в концентрации 70-75 мгlмл в трис-буфере в рН 7,5-8,5, а количество освободившейся лауриновой кислоты определяют фотоколоримет рически в виде окрашенного комплекса лаурата меди с хромогенным комплексообразователем.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. J. Biol Chem. 1966, v. 241, р. 2306.