Способ определения активности глюкоамилазы

Способ определения активности глюкоамилазы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Союз Советских

Социалистических

Республик

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (>920069 (6l ) Дополнительное к авт. с вид-ву (22)Заявлено 21 06.80 (21) 2961403/28 13 с присоединением заявки ¹ (23) Приоритет (5! )М. Кл.

С 12 N 9/34

Гооудорстееииь>й комитет

СССР ло делам иаобретеиий и открытий

Опубликовано 15-04 ° 82 ° Бюллетень № 14

Дата опубликования описания 15. 0 >. 82 (53) УДК577 ° 15 (088. 8}

А. Н. Пономарева, Н. О. Нлопак, А. П. Рухлядева, В. С. Чередниченко, Е. A. Скворцова, В. Л. Яровенко и И.Л.Ибаньес (72) Авторы изобретения

Всесоюзный научно-исследовательский институт продуктов брожения (71) Заявитель (54} СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ГЛ>0КОАМИЛАЗЫ

Изобретение относится к спиртовой и микробиологической промышленности, а именно к способам определения активности фермента глюкоамилаэы.

Известны глюкозооксидазные способы

5 определения. активности глюкоамилазы, согласно которым 0,674-ный раствор крахмала подвергают ферментативному гидролизу глюкоамилазой при 30 С в течение 10 мин, ферментативную реакцию останавливают кипячением, а глюкозу, образовавшуюся в результате ферментативного гидролиза крахмала, определяют при помощи реактивов глюкозооксилаэы и пероксилаэы, являющих- > ся ферментами, а также хромогенного вещества, например, ферроцианида ка-" лия ° Возникающая окраска отра>нает количество глюкозы, образовавшейся при

Ф действии глюкоамилазы на крахмал. Интенсивность окраски определяют колориметрически (1>.

Недостатками этих способов являются трудоемкость и длительность выполнения анализа, а также труднодоступность, сло>нность и высокая стоимость ре акт ивов, Кроме того, присутствие других амилолитических ферментов в исследуемом объекте s значительных количествах приводит к получению завышенных результатов.

Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности является способ определения активности амилолитических ферментов, в том числе глюкоамилаэы путем ферментативного гидролиза субстрата, инактивирования ферментов соляной кислотой, осветления растворов фильтрацией, поляриметрического определения углеводов в две стадии соответственно до и после ферментативного гидролиэа и расчета величины активности ферментов по специально разработанным формулам «2 >, Однако данный способ неспецифичен и предназначен для определения общего суммарного действия всех амилолитид 1 дП и t где и - количество фермента, взятое на ферментативной гидролиэ (мп или г); время ферментативного гидролиэа (минI;

3 92006 ческих ферментов, имеющихся в исследуемом объекте.

Недостатком способа является также неоднозначность получаемых результатов иэ-за различий в величине удельного вращения углеводов, получаемых при ферментативном гидролизе, а также необходимость осветления и фильтрования растворов перед поляриметрией.

Цель изобретения — специфическое 10 определение активности глюкоамилазы в присутствии амилолитических ферментов, а также ускорение и упрощение способа.

Цель достигается тем, что согласно способу определения активности амилолитических ферментов путем ферментативного гидролиза субстрата, инактивирования фермента соляной кислотой, поляриметрического определе20 ния углеводов в две стадии, соответственно до и после ферментативного гидролиза и расчета величины активности ферментов, в качестве субстрата дпя ферментативного гидролиза используют мальтозу, поляриметрирование ведут при 3 = 587-589 нм, а расчет ведут по изменению угла поворота плоскости поляризации на первой и второй стадиях, соответствующему количеству

30 образовавшейся глюкозы или количеству единиц глюкоамилазной активности, определяемой стандартным глюкозооксидазным методом.

Способ осуществляют следующим образом.

Проводят первую стадию анализа (контроль). В пробирку вносят 25 мл нагретого до 50 С 23-ного раствора мальтоэы в 0,1 М ацетатно-натриевом буфере с рН 4,7 (раствор мальтозы 0 должен быть приготовлен не менее, чем за сутки до анализа для установления в нем постоянной величины угла поворота плоскост и поляризации) . Затем в пробирку вносят 1 мл 5 н соля45

„e ной кислоты и 5 мл испытуемого раствора глюкоамилазы, нагретого до 50 С, После ферментативного гидролиза осуществляют 2-ю стадию. В другую пробирку вносят 25 мл раствора мальто- 0 эы, приготовленной таким же образом и нагретого до 50 С, а затем 5 мл испытуемого раствора глюкоамилазы, нагретого до 50 С, и проводят фер.ментативный гидролиз мальтоэы глюко- Ы амилазой в течение 10-30 мин (преимущественно 15 мин) в ультратермостате при 50 0,2 С.

Затем ферментативную реакцию останавливают добавпением 1 мл 5 í IK1.

После охлаждения растворов до комнатной температуры определяют величину угла поворота плоскости поляризации на поляриметре СУ-3 или на автоматическом поляриметф Е-ПЛ или СЛ, имеющих нормальную сахарную шкалу.

Определение проводят при длине волны

r1 == 587-589 нм, пользуясь трубкой длиной 2 дм, Изменение величины угла поворота плоскости поляризации до и после ферментативного гидролиза соответствует образованию из мальтозы глюкозы в качестве единственного продукта действия глюкоамилазы на мальтоэу, что позволяет получить совершенно однозначные результаты при определении глюкоамилаэы независимо от присутствия других амилолитических ферментов.

Изменение величины угла поворота плоскости поляризации до и после ферментативного гидролиза пропорционально количество глюкоамилаэы и времени ее действия на мальтоэу.

Поэтому расчет активности глюкоамилазы не требует создания специальных формул, а производится по пропорции между количеством фермента,взятого на анализ, временем его действия и величиной изменения угла поворота плоскости поляризации до и после ферментативного гидролиэа.

Расчет производят следующим образом. где Р - величина угла поворота плосН, кости поляризации на 1-й стадии (градусы нормальной сахарной шкалы); ! — величина угла поворота плосо кости поляризации на 2-й стадии (градусы нормальной сахарной шкалы);

zl - изменение величины угла поворота плоскости поляризации на 1-й и 2-й стадиях (градусы нормальной сахарной шкалы).

9200

Формула изобретения

10 ° 3

= -т®- = о, ьП вЂ” изменение величины угла поворота плоскости поляризации на 1-й и 2-й стадиях, рассчитанное на 1 мин. действия

1 мл или 1 r фермента (граду- s сы нормальной сахарной шкалы на г или мл в мин).

1 g П соответствует образованию

196,8 мкмоль глюкозы из мальтозы, 3а единицу количества глюкоамилазы О принято такое количество фермента, которое освобождает 1 мкмоль глюкозы, действуя на мальтозу при 50 С в течение 1 мин и заданном значении рН. Иэ этого следует, что 1 П соответству- 5 ет 196,8 ед.поляриметрического метода определенил глюкоамилазы на мальтозе (ГлСщ ), Исходя из этого соотношения рассчитывают акт ивност ь глюкоамилазы в 20

1 г или в 1 см исследуемого объекта.

При определении активности глюкоамилазы в культуральных жидкостях

As1)crgillhs «wamori-466 показано, что

1 ед. данного поляриметрического Метода соответствует 1,92 ед. глюкозооксидаэного стандартного метода.

Ввиду высокой корреляции результатов обоих методов активность глюксамилазы, определенную поляриметричес- ЗО ким методом на мальтозе, можно выражать в результатах глюкозооксидазного метода, являющегося широко распространненным и стандартным методом, Величина пересчетного коэффициента устанавливается для каждого продуцента, так как она является характерным свойством глюкоамилазы каждого продуцента.

Пример. На анализ взят фильт- рат культуральной жидкости Aspergillus

awamori-466. Из него готовят рабочий раствор фермента 10 мл фильтрата куль туральной жидкости вносят в мерную . колбу вместимостью 100 см и объем

Ь доводят до метки дистиллированной водой., Из анализа берут 3 мл рабочего раствора фермента, которые содержат исходного фильтрата культуральной жидкости

Величина угла поворота плоскости поляризации, измеренная на автоматическом поляриметре СЛ и полученная

69 6 на 1-й стадии (7 ), равна 11,88, а на 2-й стадии (Р, ) — 9,94

Ф о к Р = 11,88 — 9,54 = 2,34

2 34,,о

a > > 0,5 (на 1 см в 1 мин).

Гл4 = 196,8 мкмоль глюкозы 0,52

102,3 ед. поляриметрического метода на мальтозе/см культуральной жидкости, А в единицах глюкоэооксидаэного метода это будет:

ГлС„ = 1,92 х 102,3 = 196,5 ед.глюкозооксидаэного метода.

Предлагаемый способ определения глюкоамилаэы специфичен в присутствии других амилолитических ферментов, выполняется в 6-7 раз быстрее глюкоэооксидазных способов определенил общей осахарилаюцей активности ферментов и в 2-$ раза быстрее поляриметрического метода.

Простота и высокая скорость осуществления анализа предлагаемым способом позволяет значительно сократить затраты труда на определение активности глюкоамилазы, это даст экономический эффект в 60 тыс.руб. в год при использовании способа на всех заводах спиртовой промышленности, вырабатывающих и применяющих фермент глюкоамилазу.

Способ определения активности глюкоамилазы путем ферментативного гидролиза субстрата, инактивирования ферментов соляной кислотой, поляриметрического определения углеводов в две стадии соответственно до и после ферментативного гидролиза и расчета величины активности ферментов, о т л и и а ю шийся тем, что, с целью повышения точности определения глюкоамилазной активности в присутствии других амилолитических ферментов, а также ускорения и упрощения способа, в качестве субстрата длл Ферментативного гидролиза используют мальтозу, поляриметрирование проводят при Л = 587-589 нм, а расчет ведут по изменению угла поворота плоскости поляризации на первой и второй стадияx соответствующему количесTBó образовавшейся глюкозы или количеству единиц глюкоамилазной активности, 920069 8 литической активности и 1975 с "5.

Составитель Е. Воробьева

Редактор Н.Киштулинец Техред А, Ач Корректор Л. Бокшан

Заказ 2267/23 Тираж 505 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Иосква, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4 определяемой стандартным глюкозооксидазным методом, Источники инФормации, принятые во внимание при экспертизе

1. ГОСТ 20264-4-74. Препараты ферментные. Иетоды определения эмило2. Авторское свидетельство СССР

Ю 619856, кл. G 01 N 33/14, опубли к.

1977.