Способ получения уридин-5 @ -монофосфата и урацила

Способ получения уридин-5 @ -монофосфата и урацила

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ УРИДИН-5 МОНОФОСФАТА И УРАЦИЛА, включающий культивирование продуцирующих их микроорганизмов на питательной среде, содержащей источники углерода, азота , ростовые факторы, минеральные соли, и последующее вьщеление из культуральной жидкости целевого продукта , отличающийся тем, что, с целью повышения эффективности и упрощения способа, в качестве продуцента используют Штамм Brevibacterium ammonigenes ВНИИгенетика-63 ..

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (19) (II) SU (51) 4 С 12 P 1 04

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ

»»»ВСЕСОЮЗЧ И

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ t3,",,....,,„È

Н АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

1ИЗЛКОтНА (21) 3216438/30-15 (22) 16;12.80 (46) 30.09.87. Бюл. N- 36 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов (72) А.А, Нудлер и Л.И. Ерохина (53) 574.854.4(088.8) (56) Патент Японии N9 74-31117, кл. 36 (2) Д 531.42.

Donovan J Gerhard. J. Bacterial., v. 109, Ф 3, 1085, 1972. (54) (57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ УРИДИН-5

ИОНОФОСФАТА И УРАЦИЛА, включающий культивирование продуцирующих их микроорганизмов на питательной среде, содержащей источники углерода, азота, ростовые факторы, минеральные соли, и последующее выделение из культуральной жидкости целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью повышения эффективности и упрощения способа, в качестве продуцента используют Штамм

Brevibacterium ammonigenes ВНИИгенетика-63.

923186

Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности, к получению пиримидиновых производных, а именно, уридин-5 -монофосфата и урацила путем культивирования продуцирующих их микроорганизмов в азробных условиях на питательной сре= де способом прямой ферментации.

Уридин-5 -монофосфат (уридиновая кислота, 5 -УМФ, уридин-5 -монофосфорная кислота УМФ) и урацил являются структурными компонентами рибонуклеиновых кислот, УМФ и урацил находят применение в пищевой промышленности, фармакологии и служат исходными соединениями для синтеза антиканцерогенных и антибактериальных препаратов, t

5 -УМФ и урацил используются также в качестве .реактивов в различных областях экспериментальной биологии.

Известен способ, основанный на микробиологическом синтезе 5 -УМФ меФ тодом прямой ферментации с помощью актинамецентов определенных видов.

Известен также способ получения урацила путем микробиологического синтеза с помощью салмонелл.

Известные способы получения 5 -УМФ

) методом прямой ферментации с помощью актиномицетов имеют следующие недостатки: максимальный выход 5 -УМФ по патенту Японии низкий и составляет менее 1 г/л при продолжительности ферментации 168 ч на среде, содержащей в качестве источников углерода

1 Ф глюкоэу, декстран, мальтозу; в качестве источников азота пептон, мочевину, нитраты.

Получение урацила методом прямой ферментации с помощью культуры салмонелл также имеет недостатки: максимальный выход урацила низкий и составляет около 0,1 г/л при культивировании культуры на питательной среде, содержащей глюкозу, минеральные соли, казаминовые кислоты.

Целью изобретения является разработка простого и эффективного микро биологического способа получения уриУ дин-5 -монофосфата и урацила методом прямой ферментации на основе использования отечественного бактериального штамма. В предлагаемом способе в качестве продуцента уридин-5 -монофосфата и урацила используют мутантный штамм культуры Brevibacterium

ammonigenis ВНИИгенетика-63, выделенный из штамма АТСС 6872 путем вве15

55 дения в геном исходного штамма ряда последовательных мутаций, в -том числе устойчивость к высоким концентрациям 5-фторурацила. Штамм ВНИИгенетика-63 хранится в Центральном музее промьппленных микроорганизмов Всесоюзного научно-исследовательского института генетики и селекции промьппленных микпроорганизмов и имеет регистрационный номер ЦМПМ В-2198.

Характеристика штамма Br. ammonigenis ВНИИгенетика-63.

Штамм ВНИИгенетика-63 — грамположительная палочка, не образующая спор. На мясо-пептонном агаре и полт ноценной агаризованной среде Хоттингера образует колонии круглой формы, сплошные, с ровным краем, бледножелтого цвета, диаметром 1-1,5 мм.

Штрих на агаризованной среде Хоттингера: после инкубации в течение 24 чао сов при 30 С наблюдается значительный рост. Штамм ВНИИгенетика-63 ауксотрофный мутант, нуждающийся для роста в аденине. Максимальный выход 5 -УМФ при культивировании данного штамма составляет 3-4 г/л и урацила 2-4 г/л после 144 ч ферментации на синтетической среде, содержащей в качестве источника углерода глюкозу, источника азота — мочевину, источника ростовых факторов — аденин, тиамин, пантотенат кальция, никатиновую кислоту. Кроме уридин-5 -монофасфата и урацила, штамм ВНИИгенетика-63 накапливает до 2 г/л инозин5 -монофосфата и до 0,7 г/л гипо-ксантина.

Отличительной особенностью штамма

ВНИИгенетика-63 является способность к интенсивному образованию краснобурого пигмента после инкубацйи на полноценной питательной агариэованной среде в течение 48 ч. Данный признак удобен для тестирования, отбора, идентификации и хранения продуцента 5 -УМФ и урацила, что облегчает контроль за чистотой культуры при использовании предлагаемого способа.

Способ осуществляется-следующим образом. ю

В качестве продуцента уридин-5— монофосфата и урацила используют мутантный штамм Br. ammonigenis

ВНИИгенетика-63 Культуру, выращенную на агаризованной среде Хоттингера в

О течение 24 ч при 28 — 30 С, перено923186

Составитель

Редактор К. Сильнягина Техред М.Дидык

Корректор М. Пожо

Заказ 4450 Тираж 499 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 сят в колбы с посевной средой и выращивают при постоянном перемешивании и аэрации в течение 20 — 24 ч о при температуре 28 — 30 С. Затем посевной материал переносят в ферментационную среду.

Процесс биосинтеза осуществляют в колбах на качалке (240-270 об/мин) при аэрации и перемешивании, соответствующих скорости растворения кислорода 2 -3 г О /л.ч при температуре о

28 - 30 С. Посевная и ферментационная среды содержат в качестве источника углерода — глюкозу, источника азота — мочевину, источника ростовых факторов — пептон, дрожжевой экстракт .аденин, тиамин, никатиновую кислоту, пантотенат кальЦия, а также минераль.ные соли (КН РОд, К HPO,, MgSO<, Ге804, Еп80, МпС1, NaOH).

Способ, основанный на использовании предлагаемого штамма, обеспечи вает выход уридин-5 -монофосфата 3—

4 г/л и урацила 2 — 4 г/л без добавления в среду предшественников данных соединений. Помимо этого, в среде накапливается инозиновой кислоты1,5-2 г/л и гипоксантина 0,5-0,7 г/л.

Предлагаемый способ получения уридин-.5 -монофосфата и урацила методом прямой ферментации создает возможность организации промьппленного производства этих соединений на предприятиях микробиологической и медицинской промьппленности.

Пример использования предполагаемого изобретения.

Культуру штамма Br. ammonigenis

ВНИИгенетика-63, выращенную в течение

24-48 ч при 28 — 30 С на агаризованной среде Хоттингера с добавлением

:аденина (5-10 мкг/мл), переносят на жидкую посевную среду следующего состава,X: глюкоза — 2,0; пептон — 1,0; дрожжевой экстракт — 1,0; NaC1 — 0,25.

Посевной материал выращивают в

5 колбах емкостью 750 мл, содержащих

100 мл среды, на качалке, делающей

220 — 240 об/мин., в течение 20—

24 ч при 28 — 30 С. Инокулят передают в ферментационную среду в количестве 4 — 67..

Состав ферментационной среды, Х:

Раствор А Раствор Б

Глюкоза 10 К НРО 1,0

КН РО 1,0 NaOH 0,25

MgSO -7Н О 1,0 Н О вЂ” 100 мм

СаС1 2Н О 0,01

FeSO 7Н O 0,001

ZnSO4 7Н О О 0001

20 МпС1 . 4На О 0,001

Н О 100 мл

После стерилизации растворы А и Б сливают и добавляют стерильно растворы до конечной концентрации, : мочевины — 0,6, тиамина — 0,0005, никатиновой кислоты — 0,0005, панотената кальция — 0,001, аденина — 0,001;

0,0015, рН среды 7,8-8,2.

Процесс ферментации проводят в

3р колбах Эрленмейера емкостью 750 мл, содержащих 30 мл среды, соответствующей скорости растворения кислорода

2 — 3 г О /л ч при температуре 28,—

30 С на качалке, делающей 220—

240 об/мин. После 144 ч ферментации

35 в культуральной жидкости накапливается уридинмонофосфата 3-4 г/л, урацила 2-4 г/л, а также инозиновой кислотый 1,5 — 2,0 г/л и гипоксан40 тина 0,5 — 0,7 г/л.

Выделение уридин-5 -монофосфата и урацила осуществляют известными способами.