Способ получения биомассы микроорганизмов

Патент 923374

Авторы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОП ИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

К ПАТИМТУ

Соеэ Соиетсиик

Сециалмстнчвсими

Республик

С 12 P 19/04

//С 12 И 1/64 (23) Приоритет - (32) 29.07.76 фкударстзана4 квттитет

СИР ив йиааи язейретеей и атяфтттий (3l) 31639/76 (331 Великобритания (63) УД 663.15 (088.8) Опубликовано 23-.04.823юллетень № 15

Дата опубликования описания 23,04,82

Иностранцы

Филип Альберт Майерс и Дэвид Дже (Великобритания ) (72) Авторы изобретения

Иностранная фирма

«Дэе Бритиш Петролеум Компани Ля (Великобритания ) (7l) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОМАССЫ МИКРООРГАНИЗМОВ!

Изобретение относится к микробиологической промьппленности и касается способа лолучення биомассы микроорганизмов и гетерополисахаридного биополиме рв. Получаемая биомасса может быть использована как кормовой продукт, а бистпопимер - как эагуститель в пищевых продуктах ипи в нефтяной промьппленносж для применения в буровых растворах, или при разработке подземных торфяных месторождений.

Наиболее близким по технической cymности н достнгаемаму результату к изобретению является способ получения биомассы микроорганизмов, предусматриваю ший культивирование в аэробных условиях в присутствии газообразного метана иа жидкой питательной среде, содержащей источники азота и минеральные соли, метвниспользующего микроорганизма М, N9ttlwgOTnonc5 в присутствии метанопнспользуюшего микроорганизма РЭЕойоео ав и ЩсоЬаЩт 1Об\ с последукмаим выделением микробной биомассы as культурвльной жидкостя, при этом темпервтуI

2 ру культивирования поддерживают в интервале 38-45оС, в рН регулируют в ии тервале 6,4-7,4. Способ можно осущест- влять периодически и непресывно. Выход биомассы составляет 2,5-6 г/л. Биомас су сушат вымораживанием кли распылительной сушкой. Полученную биомассу можно испольэовать в качестве источил» кв белка, добавляемого в корма животным или при приготовлении продуктов пи тания тиодей (1).

Однако выход, нонучаеьптй при осуществлении известного способа, недоста точно масок.

Цель изобретения - получение наряду с биомассой и гетеропоннсахаридяого биополимера и повышение выхода целево го продукта.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения биомассы микрооргаиизмтлт, дредусматриваютив» му куш тиииро;ьание в аэробных условиях . в присутствии гаэообраэного метана ив жидкой питательной среде, содержащей источники азата и минеральные соли, 9233 метвниспольэуюшего микроорганизма

Netl>Eomoms в присутствии метвнолисполь- . зуюшего микроорганизма 99606omona5 с последующим выделением микробной биомассы из купьтурвльной жидкости, в ка- S честве метаниспользуюшегЬ микроорганизмаа используют штамм МИЪ Яот пж

me%Wanica НКПБ Ж 11221, образую= ший гете рополисвхвридный биополимер, в в качестве метвнописпользуюшего мик- 1о рооргвниэмв используют штвммы РМойоmonas яаЕор Е.а НКПБ И 112З0 и/или Р99о6овопаь еаИорЪЙИ НКПБ

N 11255, и/или РвеОфовощВ mqEtopbiba

НКПБ М 11257, и/или F8globacter ivan аЬ.сбо НКПБ N 11254 и/или ЖЮоЬасС8eivm saba)n НКПБ - 11256, и/или

: Ftqlob0cte7ivm Фг Ф Н КПБ Ив 11258, и/или ЯщоЬасЫгivel 5t„a,n НКПБ

Ию 11229, при этом для выделения гете- и рополисвхвридного биополимерв из куль турвпьной жидкости последнюю нагревв1от до 50-90 С.

Йля осуществления способа используют специально подобранный метаниспощ зующий штамм Np&39oenoOS metbdn co

НКПБ hb 11221, который продуцирует розовый (красный) пигмент и придает т полученной биомассе цвет мяса. Этот штамм в качестве источника азота мо жет использовать элементарный азот, В качестве метвнолиспользуюших мик- роорганизмов исцопьзуют штаммы бактерий иэ родов РМобо томяи НаМОЬаСМ(чие, которые представляют собой подвижную 35 или неподвижную грвмотрицвтельную палочку, которая может расти на такой питательной среде, квк агар. Эти штвммы переданы в Национальную коллекцию промышленных бактерий (Г. Абердин, Шотландия), где им присвоены соответствующие номера,.

Способ можно осуществлять либо не прерывно, либо он может включать как непрерывные, твк и периодические стадии. 4S

Предпочтительно осуществлять способ непрерывно в условиях установившегося режима, с включением или без последующей стадии периодического култивирова- ния. SO рН бульона нв протяжении культивирования обычно поддерживают в интервале

5,0-8,0, предпочтительно в интервале

6>0-7,0. Для поддержания. желаемой величины рН в бульон можно добввлять тв- Ы кив щелочи, квк гидроокиси щелочных металлов, или гидроокись аммония, ипи аммиак. Когда для поддержвнии рН используют

74 4 аммиак или гидроокнсь аммония, то в качестве источника вэота могут служит также ионы аммония, Когда ионы аммония присутствуют в концентрациях, превышающих определенный пороговый уровень, то они ределенный пороговый уровень, то они могут ингибироввть рост или сннжвть скорость роста бактерий, усввиввющих метан и образующих биополимер. Концентрация ионов аммония в бульоне не должна превышать 100 мг/л и, предпочтительно должна быть в интервале 2-50 мг/л.

Температура может быть в интервале

25-55оС Обычно процесс проводят при температуре в интервале 28-35 С.

Газом, содержащим свободный кислород, является обычный воздух. При непрерывном способе и промышленноприемлемых выходах продукции используют отношение в смеси метвн/воэдух таким, чтобы соотношение газа, содержащего метвн, к подаваемому в бупьон воздуху находилось в интервале, который соответствует отношению от 1 объема метанв к 2 объемам кислорода до 2 объемов метана к 1 объему кислорода. Предпочтительным соотношением является отношение 1 объема метана к 1 объему кислорода.

Установлено, что двухствдийный процесс приводит к повышению выхода биополимера. Нв первой стадии культивирование является непрерывным. Культивируемый бульон, получаемый на первой стадии, подвергвют нв второй стадии периодическому культивированию в присутствии газа, содержащего метан, и rasa, содержащего кислород, s таких условиях, что рост усввиввюших метан и вырабатывающих биопопимер бактерий штамма

И М1ч1оп>опцц ограничен эа счет умень-. шения или отсутствия других источников питвния, кроме метанв или кислорода.

Таким источником питания может быть такой источник азота, квк нитрат.

Когда используют один фермент, или когда способ осуществляют в две ствдии, ферментер или фермеитеры обычно могут содержать один или более импеллеров и систему труб для продувки для достижения хорошего перемешиввния бульона и высокой скорости передвчи газа.

Биомассу можно выделять из куль» тивируемого бульона с помощью центрифугироввния либо фильтрованием. Биомассу перед центрифугироввнием или фильтрованием можно осадить или флоккулироввть для облегчения выдепения.

923374

Подходяшнми осаждеющими или флоккулируюшими агентами являются такие нейтральные соединения, как спирты, кетоны, простые эфиры и такие ионные сое динения, как соли четвертичного аммония. Таким образом, выдеценная биомасса может быть смешана или свободна от биополимера. Способ выдепения опредепяется требованиями к выделяемому продукту. Так например, способ, состо- щ. яшнй в цеитрнфугированни, можно испопьзовать для получения биомассы, свободной от биопопимера.

Можно использовать,известный способ выделения иэ водных растворов полисаха- g ридных полимеров для выдепения гетеро» пописахаридного биополимера из культуральной жидкости (бупьона) осаждением, фильтрацией или центрифугированием. Перед выделением бнополимера культурапьный бульон нагревают до 50-90©С и иэ него удаляют основную массу микробных клеток (биомассу).

В резупьтате анализа образцов биополимера получены данные по содержанию остатков в расчете на полный вес сахарида, %:

Глюкоза 38-48

Фуккоэа 1 1-20

Манн оэа 7-21

Гапактоэа 1 1-18

Уроновая кислота 10-20 или более точно, глюкоза 38-48

Фуккоза 16-20

Ман поза 6,5-1 2

Гааактоэа 12-18

Уроновая кислота 10-19

Остатки сахаридов, главным образом, связаны в (Ь -конфигурации. Молекулярный вес гетерополисахаридов может со ставпять епичину в интерва 5,0 10 2,5 Х 10, предпочтительно в интереапе

1,0х10 -200х10 по .данным гея щ1ю никаюшей хроматографии. Обычно удеа ное врашение полимера составляет (d ) менее, чем 10 . о

Пример 1. 20 л водной пита" тельной среды спедуюшего состава:

НЗPO+ 100,0 мг

H g90q 4,0 мг нко 388,0 мг

50 28Ä0 мг

М(ф304 7Н О 53,0. мг

Са (ч0 y) g 4H 0 20,0 мг

CuS04 5НпО 1,6 мг

Fe50g 7Н10 2,4 мг

Ь 50 7Н10 0,9 мг

NnSO4 Н 10 0,16 мг

Co(0g)q 6Н10 0,14 мг

На 1Мо0 2Н О 0,44 мг

N Cfq 6Н 0 0,01 мг

НАВОЗ. ЬН 10 0,20 м1.

Дисти лпнрованная вода До1л добавляют в ферментер, попная емкость которого составляет 30 и. Ферментер. снабжен имлеллером для перемешивания бульона и приспособлениями для аэрации и подачи метана в бупьон, Укаэанную среду перемешивают при скорости импеллера 500 об мин. Величину рН устанавпивают 6,6 и поддерживают с помошью автоматического приспособления .дпя тнтрования, добавпяя 2,0 н водную гндроокись натрия.

Поддерживают 30оС, а воздух и метан подают со скоростью 3 об/об/ч и

150 об/об/ч соответственно. Скорость разбавления 0,05 ч- достигают, отводя среду со скоростью 1,0 и/ч и поддерживая постоянный рабочий объем в ферментере эа счет добавления свежей водной питательной среды. Воздух и метан, подаваемые s ферментер, не подвергают стерилизации, так что процесс проводят в нестернльных условиях.

Ферментер инокулируют каждый день в течение 7 дн. порциями по 100 мп отдельно приготовленных образцов, которые содержат метаниспользуюшие микро организмы. Образцы приготавливают спедуюшим образом. 5 мл образца почвы, ила и воды иэ пруда, взятые иэ такого места, где можно ожидать напичне использующих метан микроорганизмов, добавляют в 100 мп среды "ММ5".Среду

"ММЬ" приготавливают по известному рецепту. Затем каждую колбу закрывают пробкой Сабасип . 50 мл воздуха в копбе заменяют с помощью шприца 50 мп метана. Затем коцбы инкубируют на врашаюшемся вибростенде при 30 С в течение одной недепи. Газовую фазу s копбах обновляют каждые 2 ди.

Спустя недецю в ферментере в питательной среде набшодается рост микробов,Спустя 5 ан. скорость подачи метана понижают, а скорость подачи воздуха, скорость перемешивания скорость разбав пения, давпение в фермейтере и концентрацию солей в подаваемой минеральной среде для фермеитации постепенно увеличивают до получения скорости подачи воз духа 120 об/об/ч, скорости подачи метана 0,075 ч ",давления в ферментере

0,7 бар по манометру и концентрации питательных солей в среде,s 18 раэ пре7 9233 вышвюшей исходную. За этот период вре- мени, пока осушествляют эти изменения, концентрацию кислорода, растворенного в бульоне, поддерживают не превышаюшей величины, соотъетствуюшей 10% насышения воздухом. В этих условиях был достигнут установившийся режим. Бульон при этом розово-красный и вязкий. Концентрация микробных клеток 12,0 r cyхого веса на 1 л. 1о

Образец, взятый из бульона, подвергли центрифугированию при 30000 $ в течение 3 ч, в результате этого получили, с одной стороны, твердую фракцию, окрашенную от розового до красного цвета, состояшую, главным образом, из микробных клеток с некоторым количеством гетерополисвхвридного биополнмера, а с другой стороны - водную нвдосадочную жидкость, вязкую и почти бесцветнтю.

Надосвдочнвя жидкость содержит растворимый гетерополисахвридный биопопимер, который осаждают, добавив такой полярный рвстворитель, квк нзопропанол, этанол или ацетон. 2$

После 500 ч работы в установившемся режиме, образец бульона, взятый не посредственно иэ ферментера, инокулиру-!! !! ют на ИМЯ скошенный агар и инкубируют в герметичные пластиковые контей- З< йеры, содержашие атмосферу 1:4 метан/

/воздух при 30 С в течение 7 дн. На агвре развивалась смесь культур, содержашая, по крайней мере, один микроорганизм, усваиввюший метан и вырабвтываю!

$ ший биопопимер. Культура была розовокрасного цвета и по внешнему виду напоминалв слизь.

Анализ культуры показал, что она состоит йэ 80% штаммов бактерий МИ.Ь о

9omonaS усваиваюших метан и элементарный азот и образуюших гетерополисахаридный биополимер, который был признан штаммом Ме»ИчВоп!опоя тпМЪаФм НКПБ

Ж 11221, и 20% смеси гетеротропных бактерий, включая, по крайней мере, один штамм Иачо ьас егюгй etna(n штамм

9Seudomonae taaBoph_#_ia и несколько неидентифицированных штаммов, похожих иа виды Р%06отпопаэ и AGcaQlgenes.

Из этой смеси были выделены и

$0 идентифицированы штаммы Hauobac+eT" ощ

Qtraan НКПБ N 11229 и штамм Pseuc3omana% и!а РЪЮ а HKn5 N. 11230.

Каждый иэ штаммов бактерий был выделен в чистую культуру. Метанисполь$$ эукхций и образующий биополимер штамм бактерии МеИчботопак tnetbanica НКПБ

Ж 11221 был культивирован, охврактеПодвижность

Грамм-реакция

Образование розетки+

Рост на вгаре "ММЬл прн вес. (об.) 0,1% метанола

Рост нв агвре "NMS при вес. (об. ) 0,5% глюкозы

И т колонии

Розовый/ красный

Тип Т, (днскн ) !

Тип мембран! и установки»

Рост при 37оС

Рост прн 45 С

Усвоение элементарного азота

Образование пленки в статичной жидкой культу-ре "КЩ!:!

55+ 2

Gi и С отношение, %

По известной методике.

Приведенные в табл. 1 данные убедительно свидетельствуют о том, что штамм

l!!» 11221 можно классифицировать как штамм бактерий 8tehhgfpo!onas rnQhanica.

Однако штамм М 11221 отличается от описания всех известных штвммов М.

>< а»СО по своей способности усваи« вать элементарный азот в качестве источника азота.

В табл. 2 представлены характеристики гетеротропных бактерий, штвммов FRaМОЬасМ! алого В nain НКЦБ И! 11 229 и PSev6oxonas тпаИор !161а НКПБ

М 11230, выделенных из ферментерв при скорости разбавления 0,075 ч

74 8 ризоввн и идентифицирован в соответствии с известной методикой. Гетеротропные бактерии были идентифицированы в соответствии с известной методикой.

В табл. 1 приведена характеристика

МЮП80!пса O!eKhanica НКПЕ N 11221, выделенного из ферментерв при скоростях разбавления 0,03 и 0,075 ч ".

Таблица 1

923374

Таб лила 2

НКПБ И 11229 НКПБ % 11230

Показатели

Морфология колонии и Желто-оранжевая размер после 24 ч инку- непрозрачная колобировання на МА ния диаметром

3 мм

Грам-штамм

Отдельные. жгутики

Разжижение желатина

Усвоение Малоната

Hg, из нентжа воды

Рост в леитоиавай водноя сакариои Я еды.:

Глюкоза

Сахароза

Лактоза

Микроскопические исследования

ПОдВижнОсть и Образова» ние жгутиков

Анаэробный рост íà NA

Рост на ataðå "НМЪ", содержашем 0,1 вес.%/об} метанола

Тест на оксидаэу

Тест на каталазу

Тест на уреазу (по

Христенсену) Рост в среде КСЙ (Мюллер) Восстановление нитрата

Усвоение нитрата (Коэерс) Тест МР

:Тест ЧР

Индольный тест (реагеит

Ковака) Палочки 0,75уа М к 3-Sp,М

Палочки 0,5 Мк

Х 5,цМ

Беловатая бесцветная колония диаметрам

1 мм

923374

Продопженне твбп. 2

Мвльтоэа

Маннитол

Дупцитоп

8Т

Адонитол

ЯТ

Арабиноэа

Инози тол

Сорби тол

Трего поза

Кси лоза

НТ

КТ

МТ

Примечание:

Все тестовые испытания проводили прн инкубировании при 30 С i положитепьнвя реакция; отрицатепьная реакция; переменная: не определяли; питательный агар; среда нитрвтных минеральных солей

VN -NA . "М%"Пример 2. 4 5 л водной питаЗ5 тельной среды состава, указанного s прамере 1, помещают в ферментер емкостью 7 л.

Ферментер снабжен импеллером дпя перемешивания бульона и приспособлени о ями для аэрации и подачи метана в бу3lb0aе

Среду перемешивают при скорости им= пеллера 1000. об/мин, нагревают до

ЗООС, и далее поддерживают эту темпе ратуру, рН среды устанавливают 6,7 и поддерживают далее на этом уровне, да бавляя 2 и. NaOH с помощью автоматического приспособления дпя тытрования, Затем s ферментер засевают 500 мл инокуляита, подученного s соответствии со следующей методикой. В 5 колб, хаждая

as которых содержала по 100 мл сте,рильной жидкой среды " NMC" инокулиру- ют по одной полной петле смесью куль. тур, как и s примере 1, на выращенной

5S поверхности MC скошенного агара. Каждую as колб закрывают пробкой "Сабасаа, вводят газовую смесь, состоящую иэ 20% метана по объему в воздухе, и инкубируют на роторном вибростенде при

30 С в течение 4 дн.

Сразу после инокулироввния среда слегка помутнела. Метан подают в ферментер со скоростью 75 л, ч/15 об/o6/ч, а воздух - со схоростью, меньшей 1 и/ч, твк что концентрация кислорода, растворенного в среде, в соответствии с данными пробы на растворенный кислород, не превьпдала 20% от насышвюшего воздуха.

Культивирование проводят нестерильно, используя условия периодического процесса. Спустя 24 ч плотность микробных клеток стала слегха возрастать, а концентрация растворенного кислорода нвчаив падать Н& этОЙ стадии скОрость по» дачи воздуха увеличивается до 30 л/ч/

/6 об/об/ч. Спустя еше 8 ч скорость импеллера увеличивают до 1500 об/мин и начинают нещнэрывный процесс, вводя минеральную водную среду, состав которой приводится ниже, в ферментер со скоростью 150 мл/ч и выводя иэ ферментера бульон с такой же скоростью, дпя поддерВид в Микроскоп

Морфология «оионии и размер ее через 48 ч на МА

1ХЗ 4 шт, биестяшие круглые лимонные колонии диаметром

2 мм

1Х4 шт. красно-бе вае копании диаметром

1-2 мм

1-5 шт.

KPRCH иимонные колонии диаметром 2 мм

0,5Х

Х2 шт, бесцвет ные точечные ко ионин

1У5 шт. жеитооранжевые прозрачщае коионии диамет- ром 3 мм

13 9233 жання постоянного рабочего объема 5 и, (достигнутая скорость раэбавиения составииа 0,03 ч-"):

Н Р04 1600 мг

НРО, 64 мг

НЙО 6208 мг

К 180 448 мг

М й04 7нл О 848 мг

Са(ЙО ° )q 4Н О 320 мг

Со%04 5Н10 25 мг to

Геб04 7Н О 38 мг

2лВ04 7Н О 14,5 мг

МЮ04 Н 10 2,5 мг

Со(МО ) 6Н О . 2,3 мг

HEN oO4 ° 2Н 10 7,0 мг

М СО 1.6Н О 0,2 мг

Н В0 3,0 мг

Дистиллированная

soaa Qo 1 и

После следующих 60 ч непрерывно го процесса скорость подачи воздуха rio степенно повышают до. 220 и/ч/44 об/

/об/ч, а скорость подачи метана постепенно уменьшают до 40 и/ч/8/об/ч/, а скорость импеииера повышают до 2000, 2s об/мнн. рН бужона устанавливают и поддерживают на уровне 6,7 за счет добаэиения 2 н. гидроокнси натрия, а темйературу поддерживают 30 С. B этих уСиовиях куиьтивирование происходиио в ус- зо тановившемся режиме. Бущ»ои быи вяз; кий и цвет его розово-красный. Сиопа продуцирувтся со скоростью 0,1 г/а/ч» а микробная биомасса - со скоростью

0,27 r/n ч 1в результате чего поиучааи поиную р биоиоиимера и биомассы 0,37 гlи ч.

Бульон ss фермеитера собираю и по» дают в центрифугу, рФЬтающую с высокой скоростью до. 25000 с .Uеитри rи» руют буиьон со скоростью 250004 в течение 3 ч. Получают прозрачную вязкую жидкость, содержащую гетеропоииса»

74 14 харндный бнопоиимер н розово-красный осадок микробной биомассы, содержапшй некоторое количество биопоиимера.

Анализ популяции микробов, присутствующих в бульоне прн установившемся режиме культуры, доказывает, что она состоит нэ около 80% по числу клеток микроорганизма, усваиваютего метан и образующего бнопоиимер 88tb gonianaS

eetbanica НКПБ Ж 11221 и 20% по.чио иу клеток смеси гетеротропних бактерий.

Около 50% от чисиа гетеротройнйх бш тернй, как было опредеиено, составияии малоподвижные аэробные грамотрицатеж ные . папочки РЬйчо йСФВг uw Мга n

НПКБ ¹ 11256. Окопа 30% от чисиа: этих бактерий составияи штамм FkavebOCCerium strain НКПБ И 11229, описанный в примере 1, н окоцо 5% от чнс иа быин подвижные аэробные грамотрицатепьные палочки ИачоЬасМ ц SCea(n

НКПБ % 11258. Остальные, примерно

15% от числа составияюшнх смесь бактерий, а именно штаммы МачоЬсс18 цю фта и, Риц5ощоща н аВЫрМВ а .и Рйемдоmanas лаИорМВ а под номерами HKtIB.

11254, 11255 и 11257 соответственно.

Очень небоа шое коиичество других ге» теротропных бактерий также присутство

sano, однако их не выдеияин дия цепей идентификации. Данные, полученные .на основании различных диагностических тестов ans штаммов бактерий, выдеиен- * ных из бульона, приведены в таби. 1-3.

В табл. 3 представиены характеристики гетеротропных бактерий ЛачоЬайеммл

ЙЬгсба н РМцйьйбпсВ юаИорФнйа штаммов

НКПБ М 11255, 11256, 11257 и

11258, выдеиенних из фермеитера при работе в установившемся режиме непрерывного процесса, в усиовиях по примеру 2е

Табпи ца 3

02ЗЗ74

1Г, Продолжение табл. 3 ь

Грэм-штамМ 1

2 цопяр» ных жгу- + тика

Подвижность и образование жгутиков

Анааэробный рост на М4

Тест на оксидаэу (метод пластинок) Тест йа каталаэу

Разжижение желатина

Восстановление нитрата

Усвоение нитрата (Козерс) Усвоение мапоната

НТ

Тест МР

Тест ЧР

Индопьный тест (реагент Ковака) Heel иэ TS2

Кислота иэ пурпурного молока 8Т

П р и м е ч а н и е. Инкубирование проводипи при ЭОоС;

+ - положительная реакция;

- - отрицательная реакция;

NT не испытывапи;

О - нет роста;

ТМ - тройной, сахарный ионный: агар Dltco

NA - питательный агар.

Рост в пептоновой водной . сахарной среде: (глюкоза, сахароза, цактоза, манннтоп, дупцятоп) При сопоставпеяии результатов примеpos 1 и 2 видно, что при непрерывном культивировании при скорости разбавления как.0,03 ч ",так и 0,075 ч доминирующим микроорганизмом является метаннспопьзукяпнй и образующий гетеропо0

0 жюсахаридный полимер штамм NethaPomo nag

m9thOnk НКПБ М 11221 и одним из доминируюших гетеротропных бактерийвЂ” штамм Иа оЬасМг е вЬ.а ВКПБ

34t 11229. Остальные гетеротронные бактерии в культуре могут меняться и

Табл ица 4

26,5

7,6

7,2

23,6

6,6

14,4

19,4

5,6

36,0

4,9 Зашкапипо

72,0

Кажущаяся вязкость, сП 23 21,5

Пластичная вязкость, сП 16 15

Предел текучести, фунт/100 кв. фут;

14 13

17 92337 зависимости от конкретных усповий ферментации, однако являются стабильными для конкретного набора условий и выбраны дпя условий ферментации.

Была проведена оценка сходства мик.робной биомассы с мясными продуктами в соответствии со спедуюшей процедурой.

2 и бульона, описанного выше, подвергпи центрифугированию при 33000 4 в течение 3 ч в высокоскоростной охлажденной центрифуге МбЕ-25 дпя получения твердой фракции, состоящей, главным образом, иэ микробных клеток с небольшим количеством гетеропописахаридного биополимера. Твердый продукт, высушипи суб-15 лимационно с использованием серийного

CB 12 субпиматора. Найдено, что сублимированный твердый продукт содержит около 95 вес.% биомассы и около 5% биопопимера. 5 кг твердого продукта эа- прессовали в виде темно-красной текстурированной массы. Массу ларезапи на Змм кубики, суспендировапи в дистиллирован« ной воде и термообрабатывапи под давлением в течение 15 мин, После охпаждения до комнатной температуры оказалось, что кубики сохранили свою структуру,увепичившнсь в 2-3 раза в размерах. Структурированные ломти имени вид кусков постного мяса. Охлажденные кубики оставались стабипьными при интенсивном перемешивании.

Гете ропописахаридный биопопимер, по пученный при ферментации, бып выделен и охарактеризован в соответствии со сле» дующей процедурой.

12 и бульона, содержащего биомассу и биополимер, полученные в условиях установившегося режима непрерывного выращивания культуры, как было описа- „ но в примере, разбавили 12 л воды и пропустили со скоростью 75 см /мии через центрифугу "S%61$88S T>P9 16, работающую при 17000 с(, для удаления ° большей части биомассы (клеток бакте рий). 11 и надосадочной жидкости выделили после удаления биомассы и суб пимировапи, используя субпиматор "86й©(С 12".

4 18 при 30оС. Полученные при этом вязкостные характеристики приведены в табл. 4.

Вязкостиые свойства биопопимера 1 испытали затем в соответствии со следующей процедурой в типичной композиции дпя бурения нефтяной скважины.

Образец биополимера 1 введен в композицию типичного бурового раствора, Композиция 1

Морская вода 350 см

Карбонат натрия 2,5 г

Бентоннт 5,0 г

Хпорнстый калий 35 г

Декстрид 3 г

Карбоксиметипцеллюпоэа низкой вязкости (НВ-КМБ) 2 г

Биополимер, образец 1 2,5 r рН раствора 9,3. Вязкость измеряли на вискозиметре Farm V-Q. Полученные при этом данные приведены в табл. 5., Таблица 5

Получили 25 г твердого гетерополя сахаридного биопопимера цвета буйво повой кожи. Этот образец обозначаю номером 1.

Сублимированный биополимер помес» тиди В морскую водуу В результате че го получили раствор 0,24 вес .%/об, Вязкость раствора изме или вискоэимет ром Брукфипьда (Ul. приспособление) Композиция 2.

Вторую композицию дпя бурового раствора получили с биопопимером образца 1 в соответствии с композицией по примеру 1, топько добавили гидроокиси нат рня (0,5 г) дпя повышения рН до 9,9.

Вязкость раствора измеряли на вискозиметре Feet< V-6. Полученные данные приведены в табл. 6.

Таблица 6

923374

Предел текучести, фунт/кв. фут

14 13

291

437

873

1310

2620

Кажущаяся вязкость, сП 23 21,5

Пластичная вязкость, сП 16 15

Полученные данные свидетельствуют о том, что этот биополимер является под- is ходящим материалом для включения его в компОанции буровых растворов для неф: тяных скважин.

Второй образец биополимера был выде« лен из бульона и его вязкостные характе-go ристики оценены следующим образом.

6 л бульона центрифугировали при

33000 в течение 3 ч на высокоскоростной охлаждаемой центрифуге ME-25, 4 л надосадочной жидкости выделили пос- zs ле удаления биомассы и сконцентрировали до 1 л при пониженном давлении в pQ торном испарителе. К концентрату при ин» тенсивном перемешивании добавляли 2 л изопропанола для осаждения полимера. Зо бсажденный материал выделили из надосадочной жидкости путем центрифугнрования, промыли водным иэопропанолом (90% об./об.) и высушили в вакууме, в результате чего получили 7,5 г бело-коричневого порошка полимера, который обозначили как образец 2.

Порошок поместили в морскую воду, . до получения 0,54% раствора полимера.

Вязкость раствор определяли вискоэимет-,о ром Брукфипьда (04 приспособление) при 30oC. Характеристики вязкости приведены s табл. 7.

Следующий образец (образец > } полимера выделили иэ бульона н его характеристики сдвига определили в водном растворе следующим образом.

1,2 л бульона центрифугирования при

33000 в течение 2,5 ч в высокоскоростной охлаждаемой центрифуге МЕ х

<300 ????> надосадочной жидкости сконцентрировали в 10 раэ и сублимировали

S сублиматоре 38гiaK C5i1 . Часть сублимированного бнополимера растворили в морской воде (0,4 вес,%/об.) и вязкость измерили реогониометром Вайсенберга.

Пример 3. Следуюшие образцы биополимера были выделены из бульона, полученного в соответствии с методикой, описанной в примере 2. Эти образцы были помечены номерами 4-6. Некоторое количество образца 4 поместили в морскую воду для получения 0,75% раствора вес./o6. Затем вязкость раствора измерили для ряда увеличиваюшихся и уменьшаюшихся скоростей сдвига на внскоэиметре Наале %utopia C,o, используя стандартные системы ЙЮ Ьо с aud СнР.

Полученные данные приведены в табл.8.

Таблица 8

Таб.лица 7

7,6

7,2

26,5

14,4

6,6

23,6.5,6

36,0

19,4

4,0

72,0

Эти данные демонстрируют обратимость вязкостных характеристик сдвига водного раствора полимера.

С помощью поляриметра Хильгера было измерено оптическое вращение некоторого количества образца 5. Величина о удельного вращения с l O составила-26, о о

Определение молекулярного веса провели для образца 6, используя известную методику гельпроникаюшей хроматографии и хроматограф Устерса GPC/A 1- С-244, 5S снабженный пятью колонками (2 фута х х3/4 дюйма; 60,96 см х 19,05 мм), соединенными последовательно и набитыми пористым стеклом с диаметрами пор

21. 923 37 4 22

2000, 1250, 700, 240 и 75 А соответ- роокисью бария, выпавший в осадок суньственно. Установку капиброввпи, испопь- фат бария удалили центрифугированием. эуя стандартные фракции Декстрена. Бы- Основные свхариды, присутствуюшие в по найдено, что полимер состоит иэ двух гидропиэате, были идентифицированы с по»

I основных фракций гетеропописахарида со s мошью газовой хроматографии и масссредним молекулярным весом окопо 110< спектрометрии их перацетиппроизводных

<10 и 2 10 соответственно. в виде гпюкоэы, фуккоэы, маннозы и гаПример 4. 6 образцов гетеропо- лактозы, С помошью тонкоспойной хромвпнсахаридного полимера выдепи и из тографии было. показано напичие уроновой ферментационного бульона и приготовипи to кислоты. Конфигурацию связей не опре в соответствии с методикой примера 2. депяпи, однако есть основания преддопвСодержание сахврида было проанвпизиро- гать, что это, главным образом, ф -кои» вано следуюшим образом. фигурация, Образцы подвергли гидропизу при Количественный анапиэ сахаридов и

100 С в течение 20 ч в 1 н. серной ts уроновой киспоты, присутствуюших в обО кислоте, Гидропизат нейтрализовали гид- разце,. приведен в табп. 9.

Таблица 9

43,0

39, 1-47,4

16,5-19,7

7,0-11,3

12,4-17,4

10,8-18,7

Глюкоза

Фуккоза

Манноэа

Галвктозв

Уроновая кислота

11,3

18,9

20,1

8,5

l1,0

19,1

15,1

14,6

800 мг

34 мг

3000 мг

191 мг

426 мг

75 мг

12,6 мг

19,0 мг

7,3 мг

1,2 мг

1,0 мг

H 3 4 н1 0

НКО ъ

К03

М О< 7Н О

СаСВ (.ИЪ йгovS)

Со604. SHOO

WS0< 7Н 0

ZW„. 7Н,О

NnCOA нъо

CoC9 . 6нво

Из табп. 9 видно, что один иэ образцов сушественно отличается по своему составу относительно содержания фуккоэы и манноэы по срввйению с остальными

5 образцами. Достоверные пределы дпя копичества сахаридов установлены не были.

П р н м е р 6. Этот пример иллюстрирует 2-стадийную ферментационную систему, вызываюшую выход гетеропописвхарид; ного биопопимера.

На первой стадии 6,0 п ферментациоиного бульона, полученного в соответствии с методикой, описанной в примере 2, по» местипи в ферментер, полная емкость «оторого 7 л Бульон содержал прибпиэительно 80% от числа клеток Netbygomett l

tne%bantca НКПБ % 11221 и прибпи зитепьно 20% от числа клеток смеси гетеротропных бактерий. Полная концентрация клеток в бульоне составила окопо

9 r на литр (в расчете на сухой вес).

Ферментер бып снабжен импеппером и приспособлениями дпя подачи воздуха и метана в бульон.

Бульон перемешивали со скоростью

55 импеппера 1000 об/мин нагревапи и под1 о держивали температуру около 30 С. рН доводили до 6,4 и поддерживапи, исцопьзуя 2,0 н. раствор гидроокиси натрия, который добавляли с помошью автоматического рн контроппера. Метан подавали в бульон со скоростью 40 и/ч, в воздух - co скоростью меньше 10 и 100 пlч так что концентрация растворенного s бульоне кислорода, как опредецяпось с помошью пробы на растворенный кислород (1 Н Kngtnee»ttq Company) не превышала 10% от насыщенного воздуха. Водная минеральная среда подаваясь в буш

QH co cKopocThlo 600 мп/ч, а бупьон от« водили иэ ферментера с аналогичной скоростью дпя поддеркания постоянного рабочего объема 6,0 и. Это опредеципо скорость раэбавпения 0,1 чвс " Компо зиция водной питательной среды была спедуюшей:

92337 4 24 рые промежутки времени. Через 22 ч нитрата вовсе не обнаружипи. Рост был ограничен за счет ограничения источника

М а Моо ° 2Я О

Дистиллированная вода До1 п.

После первых 24 ч непрерывного купьтнвировання скорость подачи воздуха постепенно увепичивают до 220 n/÷, поддерживая уровень растворенного кислорода в бульоне ниже 10% от насышаюшего воздуха. Спустя 5 дн. в таких условиях ,установился режим нестерильного непрерывного процесса. Бульон, попучаемый иэ этого ферментера, отличался малой

< вязкостью и розовым-красным цветом.

Бупьон центрифугировали в течение 2 ч.

Анапиз надосадочной жидкости показал, что в най содержится полная концентрация карбфгидрата (антропный способ)

40 мг/П, Затем этот бульон подавали в ферментер водной стадии, в котором его подвергапи спедуюшим условиям куль- 20 тивирования в периодическом процессе.

15 и водной питательной среды, состав которой приведен ниже, мг: н ро 530

НРО 22

НЮ 2000

КРО 150

М(ЬО, 7Н по 284

CaCOy 50

СЖО, 5HgO 8,4 зэ

mS0< - 7Н О 13,0

2 юьод. 7H)0 5,0

Мп301 - 6Н 10 0>8

СоС" 6Н 0 0,7

NaMoO ° 2Н О 2,3 . поместили в ферментер емкостью 30 ц.

Этот ферментер снабжен импейпером и прнспособпениями дпя подачи метана и воздуха. Среду такого состава перемешивапи при скорости импеллера 1000об/мин4э и нагрели до ЗооС. рН среды поддерживали прн 6,0 используя 2,0 н. гидроокись натрия. 5 л бупьона культуры из первой стадии непрерывного процесса фермеитации, описанного выше, добавипи к этой среде в ферментере. Воздух подавали со скоростью 25 n/ìèí, а метан - со ско ростью б л/мнн. Скорость импеллера поддерживапи при 1000 об/ми,рн среды измерайв, но .не изменяли. Бопьше в фер ментер ничего не добавляли.

В таком периодическом культивировали иачапьная ппотность кпеток составпяаа 3 г/a (в расчете на сухой see). Пжл ность кпеток составляла l l гlл спустя

22 ч и оставалась такой до окончания

SS ферваентации спустя 46 ч.

Количество нитрата, присутствуюшего

b бупьоне, измерялось через некотоазота. Ферментацню продолжали в течение

46 ч в нестернпьных усповиях, причем эа это время вязкость бульона очень повыснпась. Вязкость иэмеряпи с помошью внскознметра Брукфнльда, модель (,МС снабженную балансиром М 3, поворачнваюшнмся со скоростью 6 об/мин. Начальная вязкость немедленно поспе инокупяции была слишком низка, чтобы ее можно быпо измерить внскоэиметром, настроенным как быпо описано выше, однако спустя

22 ч вязкость уже была 4900 сП пауз, а спустя 46 ч значение вязкости поднялось.до 10700 сП. Полное содержание сахарнда в надосадочной жидкости после центрнфугнровання бульона составпяпо 1550 мг/п спустя 22 ч н 2200 мгlп спустя 46 ч. Это указывает, что воэрастание вязкости связано с присутствием воднорастворенного экстрацелпюпярного полнсахарнда.

В конце второй стадии ферментации (т.е. спустя 46 ч) бупьон пастеризовалн, прекрашая подачу в бульон метана и воздуха н быстро повышая температуру от 30 до 60 С. Спустя 10 мнн бупьон о быстро охлаждали до ЗСРС.

Полимер выдепяпн нз охлажденного бульона спедуюшим способом.

16 и термообработанного н охлажденного буш.она раэбавипн 4 объемами дистиллированной воды и центрифугировапи в суперцентрифуге непрерывного действия

1поед1ее (модепь 1я), пспожоуп спо рость потока 80 см /мнн.

60 л центрифугнрованной надосадочной жидкости переместили в сосуд иэ нержавеющей стали и практически свободные от клеток пописахариды осадили, добавляя хпористый капнй до попучения

2 вес.% об раствора и 120 л метанола.

Осажденный материап выделили центрифугированием (И а 1дЧа1 102-В-25 центрифуга) и снова растворили в 2 и дистиплированной вацы. Продукт повторно, осадник добавлением такого количества хпористого калия, которое потребовалось для получения 2% раствора (вес.; об.) и 4 л метанола, Полимер выдепи и центрифугированием, дважды дегидрировапи двумя литрами метанола и выделили фильтрованием. Попимер высушивали на воздухе н измельчали в мопотковой мельнице, в результате чего попучипи свободно пересыпаюшийся порошок пвета буйволовой кожи.

25 8233

Элементарный анализ полимера; spa= га 14,0 sec.%; С 45,5; Н 5,4 83,3; зола 6,7.

Вязкость однопроцентного раствора в дистиллированной воде измеряют по вискозиметру Pawanti айагtes Она составляет 268 сП при.скорости сдвига

100 с " и 58 сП при 1000 с 1.

Таким образом,, полученные лродукты можно использовать в качестве цолимерного модификатора или загушакипего или сусцендируюшего агента в широком интервале вариантов применения, например, для получения композиций буровых растворов, композиций для добычи нефти, ста- 1> билизаторов эмульсий, жидких разбавнте» лей лекарственных. пуе.паратов и загус» тятелей илн .суспенднруккник преяаратов при изготовлении пищевых или «оеметических продуктов, а также красок. 26

Ф ормупа изобретения

Способ получения биомассы микроор ганизмов, предусматривающий культи«и» П рование в аэробных условиях в присутст вии газообразйого метана на жидкой пнтаt тельной среде, содержащей источники азота и минеральные сож, метаниспользуюшеге

74 26 микроорганизма WttOfomonas в прясут» . ствии метаноляспользу3ошего мнкроорганиз. ма P99 v damon с последующим выделением микробной биомассы из культуральиой жидкости, о т и и ч а ю ш н и с я тем, что, с целью получения наряду с биомассой и гетерополисахаридного биополимера и увеличения.таким путем выхода йелево го продукта, в качестве метаниспользую шаго микроорганизма используют штамм фЩ фщрщя than ca НКПБ % 11221, образующий гетерополисахарндный биаииз и«мер, а в качестве метанописпользующего микроорганизма используют штаммы

Рвечбоеопак пщ6 0Фйба НКПБ % 11230 н/нл РаЕц4о опав щдиор жа НКПБ

34 11255, и/или Рабц&отав кв еаИор ЙРа

НКПБ Ж 11257, и/илийарЪасМЙов аЬ аИ

НКПБ N. 11254, и/или F6rvobacterium Мийо

НКПБ % 11256, и/нли ТбиоьасВейчв

%1гЩ НКПБ % 11258, и/иля йачоЬасИВгкал gtea