Способ получения уреазы,иммобилизованной на неорганических носителях

Способ получения уреазы,иммобилизованной на неорганических носителях

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

О П И С А Н И Е „„д2цвз

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Союз Советских

Соииалистических

Республик.а (ф, т (61) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 01.10.80 (21) 3212763/28-13 с присоединением заявки № (23) Приоритет (43) Опубликовано 15.10.82. Бюллетень № 38 (45) Дата опубликования описания 15,10.82 (51) М. Кл

G 01N 31/14

Государственный комитет (53) УДК 577.155.33:

:616-089.22 (088.8) ло делам изобретений и открытии (72) Авторы изобретения

С. И. Дихтярев, А. В. Киселев, Б. И. Курга Ю.,С Н1ткитин„

Т. Д. Хохлова, В. Т. Чернобай и М . Янина

Московский ордена Ленина, ордена Октяб кой Ревтолйт1ии и ордена Трудового Красного Знамени ударсввтейц@Г1,, -, v университет им. М. В. Ломоносова и Науч проврврщтаенное объединение «Витаминые (71) Заявители (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ УРЕАЗЫ, ИММОБИЛИЗОВАННОЙ НА НЕОРГАНИЧЕСКИХ

НОСИТЕЛЯХ

Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к получению иммобилизованных ферментов.

Известен способ получения уреазы, иммобилизованной на неорганических носителях, при осуществлении которого 1 г поО ,ристого стекла с диаметром пор 550 А обрабатывают у-аминопропилтриэтоксисиланом кипячением в 5 /о растворе в ацетоне, потом 0,5 раствором глутарового альдегида в 0,1 M фосфатном буфере с рН 7,0 при комнатной температуре. К 1 г модифицированного таким образом пористого стекла добавляют 1 мл раствора уреазы соевых бобов в 0,1 М фосфатном буфере. (Концентрация белка в растворе уреазы составляет 100 мг/мл). Иммобилизованный фермент промывают фосфатным буферным раствором и раствором хлористого натрия.

Активность иммобилизованной уреазы составляет 1000 — 1200 ферментативных единиц на 1 r пористого стекла (1).

Недостатком известного способа иммобилизации является невысокая активность иммобилизованной уреазы в расчете на единицу веса носителя.

Целью изобретения является увеличение активности иммобилизованной уреазы.

Поставленная цель достигается тем, что при осуществлении способа получения уреазы, иммобилизованной на неорганических носителях путем последовательной

5 обработки носителя у-аминопропплтриэтоксисиланом, глутаровым альдегидом и затем раствором уреазы с последующим отделением и очисткой целевого продукта, отличительной особенностью является то, что в

10 качестве носителя используют силохром или спликагель с диаметром пор от 600 до

2000 А, а в качестве уреазы — уреазу семян арбуза.

)5 Способ осуществляют следующим образом.

Силохром или макропористый силикагель обрабатывают кипячением в растворе аминопропилтриэтоксисилана (у-АПТЭС)

20 в этиловом спирте илп нагреванием в растворе АПТЭС в воде при 60 — 80"С. Весовые соотношения у-АПТЭС и носителя составляют 1: 5 — 1: 10. После промывания растворителем носитель обрабатывают ра25 створом глутарового альдегида в воде или фосфатном буфере с рН 6,0 прн температуре 25 — 40 С. Весовые соотношения глутарового альдегида и носителя составляют

1: 10 — 1: 20. Носитель промывают водой

З0 и вводят в реакцию с уреазой семян арбу!

125183

Формула изобретения

Редактор Е. Зубиетова Тсхред А. Камышникова Корректор О. Тюрина

Заказ 1654/17 Изд. л/о 244 Тираж 883 Подписное

НПО сПоиск» Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Типография, пр. Сапунова, 2 за. Реакцию проводят в фосфатном буферном растворе с рН 7,3, содержащем этилендиаминтетраацетат натрия (ЭДТА) прп

4 С в течение 40 часов. Весовые соотношения белка в растворе уреазы и носителя 5 составляют 1: 5 — 1: 10. После окончания реакции иммобилизованный фермент отделяют, промывают тем же раствором, в котором была приготовлена уреаза и определяют его активность. 10

Пример 1. К 50 мг силохрома с удельной поверхностью 40 м -/г и средним о диаметром пор 2000 А добавляют 1 мл

0,5% раствора у-АПТЭС в воде. Смесь нагревают до 60 — 80 С в течение трех часов.

Силохром промывают пятикратной декантацией и смешивают с 0,5 мл 0,5% раствора глутарового альдегида в 0,1 М фосфатном буфере с рН 6,0 и нагревают до 25—

40 С в течение трех часов. После пятикратного промывания водой силохром вводят в реакцию с 8 мл уреазы семян арбуза в 0,1 М фосфатном буферном растворе с рН 7,3, содержащем 10 — з М ЭДТА. Концентрация белка в растворе уреазы составляет 1,0 мг/мл. Смесь выдерживают при 4 С в течение двух суток, после чего силохром отделяют, промывают тем же буферным раствором, B котором была приготовлена уреаза. Активность иммобилизованной уреазы составляла 3900 ферментативных единиц на 1 г влажного силохрома.

Пример 2. К 50 мг силохрома с удельной поверхностью 74 м /г и средним о диаметром пор 1000 А добавляют 10 мл

0,1% раствора 7-АПТЭС в этиловом спирте и смесь кипятят в колбе с обратным холодильником в течение трех часов. Силохром отделяют, промывают этиловым спиртом, 40 потом водой и смешивают с 1 мл 0,5% раствора глутарового альдегида в воде. Дале обработку проводят так же, как в примере 1. Активность иммобилизованной уреазы составляет 3400 ферментатпвных единиц на грамм влажного силохрома.

Пример 3. Им мобилизация уреазы семян арбуза на макропористом силикагеле с удельной поверхностью 70 мз/г и диао метром пор 600 А проводят так хке, как в примере 1. Активность нммобнлнзованпой уреазы составляет 1900 фермептативных единиц на 1 г влажного силикагеля.

Таким образом, способ позволяет получать препараты иммобилизованной уреазы с активностью в 2 — 3 раза оольшей, чем в известно» способе.

Способ получения уреазы, иммобилизованной на неорганических носителях путем последовательной обработки носителя у-аминопропилтриэтоксисиланом, глутаровым альдегпдом и затем раствором уреазы с последующим отделением и очисткой целевого продукта, отл ич а ю щи и ся тем, что, с целью увеличения активности иммобилизованной уреазы, в качестве носителя используют силохром или силикагель с о диаметром пор от 600 до 2000 А, а в качестве уреазы — уреазу семян арбуза.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. R. F. Adams, P. W. Carr «Coulometric

low analyser for use with immobilized enzume reactors», Analytical chemistry, ч. 50, _#_0 7, рр. 944 — 950, 1978.