Способ обработки первичнотрипсинизированных криоконсервированных клеток и кусочков органов для получения первичных клеточных культур

Способ обработки первичнотрипсинизированных криоконсервированных клеток и кусочков органов для получения первичных клеточных культур

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Союз Советских

Соцналнстмческмх ресщбеик

К АВТОРСКОМУ СВИДЕ?ЕЛЬСТВУ (61) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 12.02.80 (21) 2903757/30-15 с присоединением заявки М (23) Приоритет

Опубликовано 07.06.82. Бюллетень М 21 (53)M. Кл.

С 12М 5/00

3Ьеудвретваивб квмхтет ссср ю AQlloN изобретений и вткрьп«й (5З) 3К 578.085. .23(088.8) Дата опубликования описания 07;06.82 (72) Авторы изобретения

Б. Т. Стегний, В. С. Белоконь и Г. А. Красников

) :К

Украинский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии

1 (7I) Заявитель (54) СПОСОБ ОБРАБОТКИ. ПЕРВИЧНОТРИПСИНИЗЙРОВАННЫХ

КРИОКОНСЕРВИРОВАННЫХ КЛЕТОК И КУСОЧКОВ ОРГАНОВ

ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПЕРВИЧНЫХ КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУР монослоя (11 .

Изобретение относится к ветеринарии и биологии, а именно к применению культур тканей и клеток для работы с вирусами.

Известен способ обработки первичнотрипсинизированных клеток почек живот% ных и человека, включающий дезагарега-. цию кусочков органа растворами трипси на, эквилибрацию в защитной среде, замораживание в жидком азоте, дефростацию и последующее культивирование в виде

Наиболее близким к предлагаемому изобретению является способ консерви-, 1$ рования кусочков кожи для получения клеточных культур, включающий эквилибрацию биопсированного материала в криозащитной среде, содержащей диметилсульфоксид, замораживание: их непосред ственно в газовой аэе жидкого азота, .хранение при -196 С, последующее размораживание при 37 С, механическое измельчен не кусочков, культивирование в питательной среде и получение монож Г23.

Недостатком известного способа является то, что он расчитан на получение монослоя клеток высокоустойчивой к замораживанию ткани, какой является кожа. Он предусматривает рост монослоя клеток иэ кусочков органа, т.е. использование метода органных культур, который требует особых условий культивиро» вания и имеет ограниченное применение в практике получения монослоя культур клеток.

Цель изобретения — увеличение жизнеспособности клеток и ускорение сроков формирования монослоя.

Иель изобретения достигается тем, что проводят суспензионное культивирование .при обработке кусочков органов после из дефростации в обогащенной питательной среде, содержащей 5-30% сыворотки крови и 5-30% сахароэы, в течение 1-20 ч, а при обработке первичнотрипсиниэированных клеток до эк3 9337 вилибрации материала в криозащитной среде в обогащенной питательной среде, содержащей 5-30% сыворотки крови, в течение 1-12 ч.

Пример . Из коркового слоя почек плода коровы вырезают фрагменты размером 1-2 мм и отмывают от кроЭ ви в растворе Хенкса с антибиотиками (пенициллин, стрептомицин). Эквилибрирование проводят в криозащитной среде, 10 содержащей 25% диметилсульфоксида, в течение 1 ч при 4 С. Затем кусочки органа помещают в полиэтиленовые амнулы или пакеты из алюминиевой фолтги и подвергают замораживанию путем 1 о погружения в спиртовую ванну при -25 С на 30 мин и последующего перемещения в жидкий азот.

После хранения в жидком азоте емкости с кусочками размораживают на щ водяной бане при 40 С. Йпя частичного о удаления криопротектора фрагменты почек промывают в растворе Кребсе -- Хенсе.лайта (пропись С) с добавлением 20% сахароэы. После этого кусочки органа 2s переносят в обогащенную питательную среду, в состав которой входит смесь равных частей сред Игла; 199; 0,5% гидролизата лактальбумина в растворе

Хенкса, 15% сахарозы и 15% сыворотки крови крупоного рогатого скота, и культивируют 4-5 ч в суспензионном состоянии при постоянном механическом пере мешивании взвеси с помощью магнитной мешалки.

° 35

Обработанные таким образом фрагменчът органа подвергают последующей трипсиниэации О, 15-0,2% раствором фермен, та. Полученные клетки высевают в куль туральные емкости с питательйой средой д, для получения монослоя, Учет жизнеспособных клеток после замораживания и трипсинизации проводят с помощью.метода суправи тельного окрашивания 0,25% ным раствором трипановой сини с после»

03 4 дующим подсчетом их количества в камере Горяева. Интенсивность заполнения монослоя определяют путем измерения площади роста клеток.

Данный способ обеспечивает сохранение жизнеспособности 20% клеток и формирование сплошного монослоя на 1213-й день, т.е. как минимум, на 3-4 дня раньше, чем без предварительного суспенэионного культивирования.

Ф ормул а иэ обре тен ия

Способ обработки первичнотрипсиниэированных криоконсервированных клеток и кусочков органов для получения первичных клеточных культур, включающий эквилибрацию материала в криоэащитной среде, замораживание, дефростацию, выращивание в питательной среде и получение моноолоя, отличающийся тем, что, с целью. увеличения жизнеспособности клеток" и ускорения сроков формирования монослоя, проводят суспензионное культивирование при обработке кусочков органов после их дефростации в обогащенной пита тельной среде, содержащей 5-30% сыворотки крови и 5-30% сахарозы, в течение 1-20 ч, а при обработке первичнотрипсиниэированных клеток до эквилибрации материала в криоэащитной среде, .в обогащенной питательной среде, содержащей 5-30% сыворотки крови, в течение 1-12 ч.

Источники инфорЖшии, принятые во внимание нри экспертизе

1, Зуев B. В. Актуальные вопросы ветеринарной вирусологии. Тезисы докладов Всесоюзной ветеринарной вирусологической конференции 17-19 ноября 1976.

Владимир, 1976, ч. 1, с. 83-85. г.точсог Н.е1.аЕ Ъ Зп Vitr o

Ив 5, Ч. 14, 1978, р. 476-478.

Составитель Т. Тулякова

Редактор Т. Веселова Техред М.Рейвес Корректор Л, Бокшан

Заказ 38.63/6 Тираж 505 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж35, Раушская наб„д, 4/5

Филиал ППП "Патент", r, Ужгород, ул. Проектная, 4