Способ определения нитрофлуоресцеина в аминофлуоресцеине

Способ определения нитрофлуоресцеина в аминофлуоресцеине

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

ОЛ ИС АНИЕ

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Союз Советских

Социалистических

Республик

<и 934322 (61) Дополнительное к авт. свид-ву(22) Заявлено 10. 07. 80 (21) 2956467/23-04 с присоединениеМ заявки М (23) ПриоритетОпубликовано 07. 06. 82. Бюллетень М21 (5! )М. Кл.

G 01 М 21/76 государственный квинтет

СССР во аелаи нзебретеынй к еткрытнй (53) УДК543 426 (088, 8) Дата опубликования описания 07. 06. 82 (72) Авторы изобретения

А.Г. Степанова, Н.В. Абросимова и Н.А (71) Заявитель (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ НИТРОФЛУОРЕСЦЕИНА

В АИИНОФЛУОРЕСЦЕИНЕ

Изобретение относится к аналитической химии, а именно к люминесцентному анализу органических веществ, и предназначено для определения нитрофлуоресцеина в аминофлуоресцеине. .Аминофлуоресцеин — это исходный з продукт при получении изотиоцианата флуоресцеина (ФИТЦ), являющегося одним из основных красителей, используемых для метки белка. Качество аминофлуоресцеина характеризуют следу ющие показатели: хроматографи ческая однородность и содержание аминофлуо ресцеина (не менее 973), определяемое диазотированием )1).

Известен cnocob определения амино- тз флуоресцеина в изотиоцианате флуоресцеина, заключающийс в том, что анали. зируемый образец растворяют.в ацетоне и измеряют люминесценцию раствора при 403 нм I2 3 . Исходным продуктом при получении аминофлуоресцеина является нитрофлуоресцеин, примесь которого в гото2 вом продукте (аминофлуоресцеине) не" желательна.

Способы определения нитрофлуоресцеина в аминофлуоресцеине в литературе не описаны.

Цель изобретения - разработка способа определения нитрофлуоресцеина в аминофлуоресцеине.

Поставленная цель достигается способом определения нитрофлуоресцеина в аминофлуоресцеине путем измерения интенсивности люминесценции анализируемой пробы в среде 0,0005 Н раствора соляной кислоты при 486 и

434 нм и расчета процентного содержания нитрофлуоресцеина по формуле

< (Oq-ЭоК) ьС 250 100

> где J0- средняя интенсивность люминесценции анализируемой пробы при 434 нм;

3 93432

- интенсивность люминесценции анализируемой пробы при 486 нм; 3 - интенсивность люминесценции анализируемой пробы. с добавкой нитрофлуоресцеина при 486 нм;

К вЂ” коэффициент пересчета, равный 42;

AC - добавка.нитрофлуоресцеина,r; IO

g - навеска образца, г.

Способ осуществляют следующим образом.

Навеску испытуемого образца аминофлуоресцеина растворяют в абсолюти-. Is .рованном этиловом спирте (присутствие воды уменьшает чувствительность определения). Одновременно готовят раствор нитрофлуоресцеина 8 спирте. Затем.отбирают аликвотные части раствора аминофлуоресцеина, вводят определенные количества раствора нитрофлуоресцеина (добавки), подкисляют и через 30 мин измеряют интенсивности люминесценции растворов при 25

X =486 и 434 нм при возбуждении

Л светом с Л =450 и 343 нм соответственно. Количественное определение нитрофлуоресцеина в аминофлуоресцеине выполняют методом добавок. 30

При использовании в качестве растворителя спирта, диметилсульфоксида, ацетона, уксусной кислоты растворы нитро-и аминофлуоресцеина имеют одинаковую желто-зеленую и соизме- 35 римую по интенсивности люминесценцию, а у аминофлуоресцеина наблюдается еще и значительная люминесценция в синей области. Таким образом, определение люминесцирующей примеси нитрофлуоресцеина на фоне люминесценции аминофлуоресцеина практически невозможно. Необходимо либо разделение люминесценции этих соединений либо учет вклада каждого соединения в общую люминесценцию.

Установлено, что при подкислении спиртовых растворов амино-и нитрофлуоресцеина в области концентраций кислоты 10 -1 10 Ì наблюдается уве- 30 личение интенсивности люминесценции нитрофлуоресцеина в 25 раз, при этом у аминофлуоресцеина интенсивная синяя полоса с увеличением концентра ции кислоты в растворе уменьшается.

Этот эффект положен в основу предлагаемого способа определения нитрофлуоресцеина. В качестве рабочей концент2 4 рации выбрана 5 10 4 И кислоты, при которой наблюдается максимальное увеличение интенсивности люминесценции нитрофлуоресцеина, в то время как люминесценция аминофлуоресцеина изменяется незначительно, т.е. имеют дело практически с нелюминесцирующей формой аминофлуоресцеина.

Поскольку полосы люминесценции нитры-и аминофлуоресцеина совпадают (А=486 нм), поэтому при их совместном присутствии ийтенсивность люминесценции в этой области определяет их суммарное содержание. Так как аминофлуоресцеин обладает еще и синей полосой,, то количественную характеристику его можно. проводить как по синей (434 нм), так и по зеленой (486 нм)"полосе люминесценции. Введя коэффициент пересчета К, учитывающий соотношение интенсивностей этих полос, можно, учесть вклад аминофлуоресцеина в суммарную люминесценцию обоих соединений (нитро-и амино флуоресцеина), измеренную при 486 нм.

Коэффициент К подсчитывают по трем образцам аминофлуоресцеина, практически не содержащих нитрофлуоресцеин.

Так как интенсивность люминесценции аминофлуоресцеина при 486 нм значительно больше, чем при 434 нм, то измерение. интенсивностей люминесценции при этих длинах волн выполняется при различных напряжениях прибора. Коэффициент 42 (отношение полос люминесценции 0486/ 3434) автоматически включае .в себя и поправку на усиление прибора при переходе от напряжения 100 к 1000 В.

В табл, 1 приведен подсчет К для образца, практически не содержащего нитрофлуоресцеин.

Пример. 0,017 r аминофлуоресе цеина в 250 мл абсолютированного этилового спирта. 0,01 г нитрофлуоресцеина растворяют в 100 мл такого же спирта, 1 мл полученного раствора помещают в пробирку, прибавляют 9 мл спирта, перемешивают. Полученный раствор содержит 10 мкг/мл -нитрофлуоресцеина (рабочий раствор}.

В три прооирки емкостью 10 мл помещают по 1 мл раствора аминофлуоресцеина, во 2-ю и 3-ю - соответствеНно

0,4 и 0,8 мл рабочего раствора нитрофлуоресцеина, во все пробирки добавляют по 0,5 мл 0,002 М НС1 в спирте, 5 934322 6 спиртом доводят до 5 мл и перемеши- цеина вычисляют по вышеприведенной вают. :!ерез 30 мин измеряют интенсив- формуле. ности люминесценции всех растворов при 3- =486 нм (возбуждение ХВ=450 нм) и при = 434 нм (возбуждение

Лу343 йм). Содержание нитрофлуорес22

434

924 = 42

48б

Таблица 2 разец х,3

Д,С,г

9эг

"ср

-6

150 4 ° 10 .- 0,017

172 .8 1О 0,017

125 4 10 0,017

148 8-10 0,017

2,2 42

2,2 42

8,3

122

7,7

8,7

122

2,2 42

100

З,б

3,5

2,2 42 100

3,7

3,4

133 4 10 0,017

154 8 10 0,017

2,3-42 110

3,3

2, 3 "42

110

3,5

50 (3 " оК) A С. 250. 100 () 9

Формула изобретения

55 где )о- средняя интенсивность люминесценции анализируемой пробы при 434 нм;

Способ определения нитрофлуоресцеина в аминофлуоресцеине, о т л ич а ю шийся тем, что, измеряют

Время проведения анализа 4045 мин. Предел обнаружения О, 08 мкг/мл.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет определять примеси нитрофлуоресцеина в аминофлуоресцеине, что позволяет улучшить качество получаемого из него красителя.

Результаты определений нитрофлуо5 ресцеина в трех образцах аминофлуоресцеина приведены в табл. 2.

Таблица 1 интенсивность люминесценции анализируемой пробы в среде 0,0005 И раст вора соляной кислоты при.486 и 434 нм и рассчитывают процентное содержание нитрофлуоресцеина по формуле

934322

Составитель А. Жидикова

Редактор А. Лежнина Техред А. Бабинец Корректор B. Синицкая

Заказ 3916/37 Тираж 887 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4 интенсивность люминесценции анализируемой пробы при

486 нм; интенсивность люминесценции анализируемой пробы с добавкой нитрофлуоресцеина при

486 нм; добавка нитрофлуоресцеина, г;

g - навеска образца, г;

К = 42.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. ТУ 6-09-144-74.

2. Авторское свидетельство СССР по заявке H 2723864/04, кл. G 01 N 21/64, 1979.