Способ количественного определения антител к коллагену

Способ количественного определения антител к коллагену

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

О П И С А Н И Е (>935791

ИЗО6РЕТЕН ИЯ

К АВТОРСКОМУ- СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Союз Советских

Социалистических

Республик (6l ) Дополнительное к авт. с вид-.ву (5! )М. Кл. (22) Заявлено 18.07. 80 (21) 2966206/30-15 с присоединением заявки РЙ

G 01 и 33/56

6 01 М 33/80

Гевуддретавлый камитет

СССР ае делам язабретевнк и втхрытвй (23) Приоритет

Опубликовано15.06.82. Бюллетень М 22

Дата опубликования описания 15 . 06, 82 (53) УДК 547. 962..9.543.52 (088.8) (72) Авторы изобретения

В.М. Земсков, И.Д. Смирнов, A.Á. Алексеев Й В.П. Иасенко

Всесоюзный кардиологический научный центр АИИ -СССР,. (7I ) Заявитель (54) СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИТЕЛ

К КОЛЛАГЕНУ

Изобретение относится к медицине, а именно иммунологии, и может быть использовано для анализа иммунологических препаратов.. г

Известно определение количества антител (AT) к коллагену радиоиммуно. логическим методом, заключающееся в том, что к исследуемому раствору добавляют меченный радиоактивным

1о изотопом коллаген и образовавшиеся в ходе иммунологической реакции нерастворимые комплексы антиген-антитело (АГ-AT) отделяют соосаждением с помощью независимой дополнительt5 ной системы АГ-АТ, которая образует обильный преципитат. После серии отмывок осадка определяют количество антител в исследуемом растворе по преципитировавшей радиоактивности с помощью калибровочной кривой 13

Основным недостатком зтого метода является методологическая сложность. Кроме того, процесс маркирования коллагена "связан с использованием большого количества изотопа.

Цель изобретения — упрощение способа.

Для достижения поставленной цели согласно способу определения антител к коллагену, включающему постановку серологической реакции с исследуемым раствором и последующее измерение преципитирующей радиоактивности, предварительно проводят адсорбцию коллагена на полихлорвиниловую поверхность в буферном растворе при рН 9,0-10,0 и температуре 30-37,5оC в течение 2-6 ч, затем на полихлорвиниловую поверхность наносят исследуемый раствор и связавшиеся при этом антитела детектируют "вторыми"

" 1-антителами к иммуноглобулинам животного - продуцента .антител к коллагену.

Пример 1. Для адсорбции коллагена на полихлорвиниловую поверхность готовят раствор коллагена 1 ти3 93579 па быка в буферном растворе с рН 910. Раствор наносят на полихлорвиниловую поверхность, выполненную в виде лунки, и .выдерживают 2-6 ч при

30-37,5 С. Избыток коллагена удаляют при промывке лунок. Исследуемый раствор антител в буфере в различных разведениях вносят в лунки, AT проч.- . но связываются с адсорбированным на полихлорвиниле коллагеном, все ос- !в тальные компоненты исследуемого раст вора удаляются при промывке.-" Оставшиеся в лунке не смытые иммуноглобулины (т.е, антитела) детектируются

"вторыми" меченными (6 3 ) антителами к иммуноглобулинам животного продуцента AT к коллагену. Избыток

"вторых" AT удаляют промыванием, Ко-о личество AT к коллагену определяется по калибровочной кривой, исходя из .количества радиоактивности, специфически связавшейся в лунке.

На чертеже представлена калибровочная кривая.

Построение калибровочной кривой отличается тем, что в качестве исследуемого берут препарат чистых антител к коллагену 1 типа известной концентрации.

Пример 2. А. Получение твердой фазы.

В лунку из полихлорвинила вносят

100 мл раствора коллагена 1 типа быка (17 мкг/мл) в 0,01 М карбонатном буфере рН 9,6 и инкубируют 2 ч при

37 С и ночь при 4 С. Затем промывают о 3S

10 раз холодной водопроводной водой.

В каждую лунку вносят по 200 мкл

104-ной нормальной лошадиной сыворот ки в фосфорном буфере рН 7,0 (О, 15М КНпРО,! + 0,075M МС6 +

+ 0,023 NaN + 0,053 ТВИН-20), инкубируют 2 ч при комнатной температуре, 5 раз промывают 1/-ной нормальной лошадиной сывороткой.

4$

Б.Определение количества антител к коллагену.

В лунки из полихлорвинила с адсорбированным на них коллагеном 1 типа быка вносят по 100 мкл различных разведений в фосфатном буфере рН 7,0 исследуемых растворов, содержащих AT кролика к коллагену 1 типа быка. Инкубируют 3-4 ч при комнатной температуре, промывают проточной водой и вносят 50 мкл раствора "вторых", ме- SS ченных 3 -антител барана к иммуноглобулинам кролика 50.000 имп/мин на лунку в фосфатном буфере рН 7,0.

1 4

Инкубируют ночь при 4 С, промывают проточной водой, вырезают лунки и просчитывают радиоактивность на гамма-счетчике. Количество AT кролика к коллагену 1 типа быка в исследуемом растворе определяют по калибровочной кривой, исходя из связавшегося с лункой количества радиоактивности.

Для определения уровня неспецифического связывания в каждом эксперименте в качестве одного из исследуемых растворов используют нормальную сыворотку кролика, инактивированную при 56 С 30 мин. Для построения калибровочной кривой в качестве исследуемого раствора берут раствор чистых антител кролика известной концентрации к коллагену l типа быка.

Для разведенного в 20, 200 и

10000 раз исследуемого образца получаем соответственно 19,250, 10290 и 600 имп/мин. Исходя из внесенного ко" личества радиоактивности 50000 импlмин, вычисляют процент связывания радиоактивной метки с твердой фазой,равный 35;5; 20,6 и 1, 123 соответственно. Количество антител в исследуемом образце определяют по калибровочной кривой, исходя из процента связывания метки и учитывая разведения. Проценты связывания,.полученные для разведений -1:20 и 1:10000., лежат вне капибровочной кривой и поэтому непригодны для определения количества антител. Величина 2С,63 лежит на рабочем участке калибровочной кривой и вполне пригодна для вычисления по ней количества антител. Исходя из этого и используя данные для разведения исследуемого раствора в 200 раз, получаем, что в 50 мкл этого разведения исследуемого раствора содержйтся

9,0 нг антител, а их концентрация составляет 36,0 мкг/мл.

Пример 3. Все условия осуществления способа по примеру 1, за исключением того, что в качестве исследуемого образца используют раствор антител к коллагену 1 типа быка с исходной концентрацией 1,1 мг/мл.

Исходный раствор разводят в 4000 и

20000 раз. Процент связавшейся радиоактивности оказался равным 25,4 и

8,3i соответственно. Определенная по калибровочной кривой концентрация исходного раствора составляет

1,13 мг/мл и 1,04 мг/мл соответственно.

791 6 ные для определения радиоактивности пробы могут храниться в любых . условиях, а при использовании пере" счета на распад изотопа - практичес ки неограниченно долго. формула изобретения

5 935

Иэ примеров видно, что предлагаемый способ позволяет получить резуль-. тат с точностью 43, что вполне удовлетворяет требованиям, предьявляемым к подобным способам в биохимии.

S . Предлагаемый способ сравним по точности определения с известным жидкофазным радиоиммунологическим способом определения количества антител к коллагену и в то же время является 10 значительно более простым.

Предлагаемый способ определения

AT и коллагену 1. типа является высокочувствительным, точным, воспроиз-

Водимым, высокоспецифичным, простыму l5 технически удобным, высокопроизводительным и не требует работы с большими количествами радиоактивности.

Чувствительность метода 5-10 нг бел, ка антител в мл (0,25-0,5 нг AT в jo

50 мкл- пробы). Специфическое связывание "вторых" AT составляет 30403 от вносимой дозы, а неспецифическое 0,9-4,53. Специфическое связывание подавляется в присутствии раство- 2у римого коллагена 1 типа быка.

Предлагаемый способ позволяет де" тектировать AT к коллагену 1 типа в любых физиологических растворах.

Использование малых доз радиоактивности делает его практически пол" ностью безопасным, не требуется также никакого вспомогательного сложного оборудования. Полностью подготовленСпособ количественного определения антител к коллагену, включающий постановку серологической реакции с исследуемым раствором и последующее измерение преципитирующей радиоактивности, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа, предварительно проводят адсорбцию коллагена на полихлорвиниловую поверхность в буферном растворе .при рН 9,0-10,0 и температуре 30-37 5 С в течение 2-6 ч, затем на полихлорвиниловую noaepxHocTb наносят исследуемый раствор и GBRsaBIIIHecR hpH этом антитела детектируют "вторыми"

1Ю 3 -антителами к иммуноглобулинам животного - продуцента антител к коллагену.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1.Menzel J Radioimmunoassay for

antico11agen ant(bodies us!ng P4C3

Labelled collagen. J. tmmunol. Meth.

1977, 11, р. 77- .

935791

28 с ф 20

Ъ

31 м

4 „.

1 ф ф

Ф Я

Ф

-7нг5 иункс

ВНИИПИ Заказ 4198/44 Тираж 887 Подписное

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, Ул. Проектная, 4