Способ регенерации носителей для иммобилизации ферментов

Способ регенерации носителей для иммобилизации ферментов

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Союз Советски к

Социалистических республик

ОП ИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ iii 936987

* г (61) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 18. 09. 79 (21) 2817587/23-26 с присоепинением заявки М(23) Приоритет(5 t ) M. Кл.

8 Ol J 21/20

С 12 N 1.1/08

Ркударетеены11 кеивтет

CCCP

Io аваев взевретееив в етермтив .

Опубликовано 23. 06. 82 ° Бюллетень,% 23

Дата опубликования описания 23 06 82 (53) УДК 577 15 ,02(088.8) (72) Автори изобретения

Х.Я.Киппер, А.И.Кестнер, К.А.Кивисилла, Х.P.-P,Егоров,-—

А.К.Арен и Д.Я.Дайя

Таллинский политехнический институт и Вс союзйъФ1енаучио-;,",, исследовательский институт прикладной биЬхимьщ,-„ „,„, ьл лю i i„,, ü (71) Заявители (54) СПОСОБ РЕГЕНЕРАЦИИ НОСИТЕЛЕИ

ДЛЯ ИММОБИЛИЗАЦИИ ФЕРМЕНТОВ

Изобретение относится к способу регенерации носителей и может быть использовано при получении активированных носителей для иммобилизации ферментов.

Известен способ регенерации носителей для иммобилизации ферментов путем обработки носителя разбавленной соляной кислотой. Обработка кислотой регенерирует альденидные группы на носителе, через которые производят иммобилизацию фермента (1 $

Недостатком способа является его пригодность только для носителей, содержащих альдегидные группы. Иммобилизация через альдегидные группы не всегда дает достаточно стабильные препараты иммобилизованных ферментов.

Цель изобретения - увеличение количества активных групп на носителе для получения высокоактивных и стабильных иммобилизованных ферментных препаратов на основе органоминеральных носителей.

Поставленная цель достигается тем,что согласно способу регенерации органоминеральные носители сначала

5 кипятят в растворе брома в четыреххлористом углероде, а затем обрабатывают раствором цианистого калия в этиловом спирте.

30 Пример. 1. 5 г силохрома, покрытого полимерной пленкой — эпок-. сидной смолой, с инактивированным ферментным препаратом помещают в колбу и добавляют 18 мл 0,53-ного

15 раствора брома, приготовленного путем растворения 0,144 г (0,046 мп) брома в четыреххлористом углероде.

Полученную смесь нагревают с обратным холодильником при 60 С в течео ние 20 мин. После этого растворитель и летучие вещества удаляют дистилляцией, в результате чего материал высушивается. Получают продукт, по. 936987

2О верх ос которого покрыта пленкой,

1 имеющеи s цепи полимера активный бром.

0,048 г цианистого калия растворяют в 20 мл этанола (0,3i раствор) и добавляют к вышеупомянутому продукту. Полученный таким образом носитель промывают этанолом до исчезновения ионов цианила в промывном растворе. Получают носитель, активированный цианидом калия.

Количество активных групп на носителе определяют путем перемешивания носителя в растворе метиламина в течение 60 мин и обратного титрования непрореагирующих аминогрупп

0,1 н.раствором соляной кислоты, Сос держание активных групп в регенери рованном носителе 35-40 MK-ýêâ/r.

К 1 r регенерированного носителя добавляют 2,5 мл боратного буфера с оН 8,0, содержащего 60 мг трипсина и 3 мг ингибитора трипсина.Реакцию иммобилизации проводят при ком25 натной температуре в течение 20 ч.

После этого препарат промывают последовательно боратным буфером с рН

8,0, 1 м раствором хлористого нат.рия и боратным буфером

Ферментативную.активность препа30 рата определяют на 23-ном растворе казеина с рН 8,0 при 30 С.

Активность препарата трипсина, полученного на регенерированном носителе равняется 9,0 Elã, выход активности 11,0i.

Операционную стабильность препарата трипсина оценивают по остаточной активности при проведении промывки препарата 23-ным раствором казеина 4в с рН 8,0 в колонке в течение 20 ч со скоростью протекания казеина

0,2 мл/мин при 20 С. После такой промывки сохраняется 813 от исходной активности. 45

Активность препарата трипсина, полученного связыванием фермента на носителе, изготовленного на основе силохрома покрытого эпоксидной смолой, отвержденного полиэтиленполиамином и активированного бромцианом (первичный ферментный препарат на данном носителе), равняется 12,0 Еlг, выход активности 14,63 и после промывки

24-ным раствором казеина сохраняется 55

69,03 от исходной активности.

Пример 2. 5 г инактивированного ферментного препарата на

4 основе сипихрома, покрытого эпоксидной смолой, сначала кипятят в 18 мл

0,63-ного раствора брома в четыреххлористом углероде в течение 40 мин, как в примере 1, а затем обрабатывают 0,4i-ным раствором цианистого калия в этиловом спирте, как в примере 1.

Содержание активных групп в регенерированном носителе 47-50 мк-экв/г.

10 г регенерированного носителя смачивают 25 мл раствора панкреатина (60 мг/мл) в буфере с рН 8,0. Реакцию иммобилизации проводят при

20 С в течение 20 ч. После инкубации препарат промывают последовательно боратным буфером с рН 8,0, 1 м раствором хлористого натрия и боратным буфером. ферментативную активность препарата определяют на 2i-ном растворе казеина с рН 8,0 при 30 С. Активность препарата панкреатина равняется

41,8 Е/г, выход активности 141.

После промывки 24-ным раствором казеина сохраняется 49, 74 от исходной активности.

После инактивации ферментного препарата 5 r материала повторно обра-, батывают бромом и цианидом калия.

Иммобилизацию панкреатина проводят вышеописанным способом.

Активность препарата панкреатина равняется 37,2 Е/г, выход активности

17,2Ф. После промывки 23-ным раствором казеина сохранялось 34,53 от исходной ак йвности.

Активность препарата панкреатина, полученного связыванием фермента на носителе, изготовленного на основе силохрома, покрытого эпоксидной смолой, отвержденной полиэтиленполиамином и активированного бромцианом (первичный ферментный препарат на дан. ном носителе), равняется 37,6 E/ã, выход активности 17,73 и после промывки 23-ным раствором казеина сохранялось 45,2Ф от исходной активности.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет регенерировать различные активные группы на органоминеральных носителях с инактивированным ферментным препаратом, что обеспечивает получение высокоактивных и стабильных иммобилизованных ферментных препаратов на основе органоминеральных носителей.

Формула изобретения

Составитель Н. Строганова

Редактор Н. Бобкова Техред И. Рейвес Корректор 6. Макаренко

Заказ 4308/8 Тираж 583 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. "/5 филиал ППП "Патент", г. Ужгород; ул. Проектная, 4

936987 б ных препаратов на основе органоминеральных носителей, последние снаСпособ регенерации носителей чала кипятят в растворе брома в чедля иммобилизации ферментов путем тыреххлористом углероде, а затем обобработки носителей раствором pea- s рабатывают раствором цианистого гента, отличающийся калия в этиловом спирте. тем, что, с целью увеличения коли- Источники информации, чества активных групп на носйтеле принятые во внимание г ри экспертизе для получения высокоактивных и 1.Патент Великобритании И 1365886, стабильных иммобилизованных фермент- 10 кл. С 07 6 7/02, 1974 (прототип).