Способ получения тирозини серинсодержащих пептидов

Способ получения тирозини серинсодержащих пептидов

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

(72) Авторы изобретения

А, Д. Юхневич, И. В. Сысков, П. Я и Г. И. Чипенс

Ордена Трудового Красного Знамени синтеза АН Латвийской ССР (7I) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТИРОЗИН вЂ” И СЕРИНСОДЕРЖАЩИХ

ПЕПТИДОВ

Известен аэидный метод ступенчатого нара-1 шивания пептидной цепи с N-конца азидным сочетанием двух дипептидов или комбинация азидного метода скарбодиимидным (3(и (4(.

Применение азидного метода для синтеза пептидов с аминокислотной последовательностью

АКТГ 4 дает возможность вводить тироэин и серии в пептидную цепь с незащищенными гидроксильными группами, однако наблюдает1О ся большое число лобочных реакций, что снижает качество целевого продукта.

Наиболее близким к предлагаемому является способ получения серии- и тирозиноодержащих пептидов путем последовательного нарашивания пепткдной цепи с С-конца конденсацией защищенных по аминогруппе остатков тирозина и серила с защищенным аминокислотным компонентом в присутствии в. ка20 честве конденсируюшего агента N, N -дициклогексилкарбодиимида в ацетонитриле при охлаждении, с использованием для зашить| не встуцаюших в реакцию аминокислотных остатков бутипоксикарбонильных групп (ВОС) (61.

Изобретение относится к улучшенному спо- собу получения тироэин- и серинсодержаших пептидов, которые могут найти применение как полупродукты при синтетическом получении адренокортикотропина и его аналогов.

Известен способ синтеза АКТГ(4 методом ступенчатого нарашивания цепи с N-конца с использованием трифенилфосфита и имидазола в качестве конденсируюшего агента, при этом гидроксилы тнрозина и серина защищают бензильными группами (1).

Недостатком этого способа является необходимость защиты ОН группы тирозина и серина. Соответствующие о-бензилпроиэводные тироэина и серина являются труднодоступными соединениями. Их применение связано с применением натрия в жидком аммиаке и другими осложнениями. В то же вре-! мя при отшеплснии бензильиой группы от тироэина жидким фтористым водородом, что применяется при тотальном снятии защитных групп с АКТГ и его аналогов. происходит миграция бенэильной группы в тсртьее положение фенильиого остатка тирозина (2).

Романовски

4э У Ту"

3 1 институт органического

93744

Недостатком этого метода является то, что N N -дициклогексилкарбодиимид сильный аллерген и работа с ним требует особых мер предосторожности, что усложняет использование этого метода в укрупненных масштабах.

Кроме того, присоединение ВОС-серина и

В0С-тироэииа проводят в растворе ацетонитрила или смеси ацетонитрилдиметилформамид.

Для отщепления защитных ВОС-групп используют трифторуксусную кислоту или раствор lð избыточного количества хлористого водорода в уксусной кислоте при комнатной температуре в течение 15 мин.

Цель изобретения — упрощение процесса, улучшение условий труда, повышение качества и расширение ассортимента целевых продуктов, которые могут быть использованы в синтезе адренокортикотропного гормона.

Поставленная цель достигается способом получения тироэин- и серинсодержащих. пептидов общей формулы

2 — Y — Tyr — Ser — Х вЂ” ОЕ, где Х вЂ” Met, Nleu", У вЂ” Sar; P — Ala, Serz,Oser;

Š— метил или этил;

2 — бензилоксикарбонил, путем последовательного наращивания пептидной цепи с С-конца конденсацией защ))пценных по аминогруппе остатков тиро.@на и серина с защищенным аминокислотным компонентом в присутствии в качестве конденсирующего средства 1-этоксикарбонил-2-этокси-1,2-дигидрохинолина, с последующим снятием защитных групп обработкой хлористым

35 водородом при комнатной температуре.Процесс наращивания пептидной цепи проводят в растворе хлористого,метилена при комнатной температуре. для защиты аминокислотных остатков тироэина и серина используют

0 -нитрофенилсульфенильную группу, снятие

0 -нитрофенилсульфенильной защиты проводят раствором эквивалентного количества хлористого водорода в этаноле в течение 2 — 5 мин. Осуществление предлагаемого способа позво- 4 ляет использовать незащищенные по гидроксилу серии и тирозин при полном отсутствии побочных реакций по этим группам. Для очистки промежуточных продуктов не требуется ни перекристаллизация, ни хроматография.

Образующиеся побочные продукты удаляются экстракцией.

Органические растворители упаривают на роторном испарителе нри остаточном давле-. нии 12 — 15 мм рт. ст. и температуре 30 — М

40 С. Температуру плавления (разложения) определяют в открытых капиллярах без коррекции, углы вращения — на поляримет7 4 ре фирмы "Перкин-Элмер" (модель 141).

Электрофоретический анализ проводят на бумаге "Фильтрак-ФН 16" (ГДР) в 30%-ной уксусной кислоте (pH 1,9) при потенциальном градиенте 18 В/см в течение 1,5 ч.

Электрофоретическая подвижность соединения (В111 ) определена по отношению к гистидину. Хроматографическая подвижность определена на пластинках "Силуфол-254" (Чехословакия) в системах: н-бутанол-уксусная кислота-вода (4:1:1), бензол-этилацетат-метанол (6:2:1) и бенэол-ацетон (2:1) .

Проявление электрофореграмм проводят нингидрином, пятна на хроматограммах обнаруживают нингидрином, реактивами РейнделаХоппе, Паули и в УФ-свете при 254 нм.

Образцы для элементного анализа высушивают в течение 10 ч в вакуумном эксикаторе над пятиокисью фосфора и гидроокисью калия.

Пример 1. Метиловый эфир о-нитрофенилсульфенил-серил-метионина (1) .

К суспензии 24,1 г (55 ммоль) дициклогексиламмониевой соли о-нитрофенилсульфенилсерина в 350 мл хлористого метилена прибавляют 10,0 г (55 ммоль) гидрохлорида метилового эфира метионина и перемешивают при комнатной температуре 15 мин. Прибавляют

13,6 г (55 моль) 1-этоксикарбонил -2-этокси-1,2-дигидрохинолина и реакционную смесь оставляют на ночь. Отфильтровывают осадок гидрохлорида дициклогексиламина и растворитель упаривают. Остаток растворяют в 450мл этилацетата, промывают 5%-ным раствором

MaHC0q (4 х 50 мл), 10%-ным раствором

KHSO4 (4 х 50 мл) и водой (2 х 50 мл) ..

Упаривают и остаток сушат азеотропной отгонкой с бензолом (50 мл). Кристаллизуют из петролейного эфира, фильтруют и получают 19,5 (94,6%) желтого тещищенного Липептиие Ql), т.пл. 91 — 97 С. Rf — 0,42. Rf — 0,47. (а)

-50,6 (с 1, диметилформамид) .

Вычислено, %: С 44,65; Н 5,25 и 10,41.

С1582106ЙЗ$1

Найдено, %: С 44, 73; Н 5,26; и 10,20.

Пример 2. Гидрохлорид метилового эфира серил-метионина (Н) .

К раствору 6,05 r (15 ммоль) эащищенного дипептида (!) в 200 мл абсолютного этанола прибавляют 10 мл 1,5 раствора хлористого водорода в абсолютном этаноле и выдерживают при комнатней температуре 2 — 5 мин.

Растворитель уцаривают и остаток встряхивают с 300 мл воды и 50 мл этилацетата. Этилацетатный слой отбрасывают и водный слой промывают эпщацетатом (5 х 50 мл). Водный раствор перемешивают с активированным углем при комнапюй температуре 2 ч и фильт-, руют. Упаривают воду досуха и полученный

5 свободный дипептид (И) без дальнейшей кристаллизации используют на следующей стадии

С!

047 Емцов= 082

Пример 3. Метиловый эфир о-нитрофенилсульфенилтирозил-серил-метионина (И!) .

Получен аналогично защищенному дипептиду (!) (пример 1) из дишпслогекснламмоииевой соли о-нитрофеннлсульфенилтирозина и гидрохлорида дипептида (И). Продукт представляет собой желтое аморфное вещество. Выход 85%, т.пл. 78 — 88 С. R = 043 RС = 034 (o,J—

546

= + 34,4 (с 1, дмметилформамид).

Вычислено, %: С 50,87; Н 5,33; Й 11,31.

Сг4Нз Ой40в $г

Найдено, %. С 52,27; Н 5,33; и 11,26.

Пример 4. Гидрохлорид метилового эфира тироэил-серил-метионина (IV) .

Снятие защитной группы с защищенного трипептида (I I I) проводят аналогично снятию с защищенного дмпептнда (t) (прммер 2).

Гидрохлорид трипептида (IV) представляет собой аморфное гигроскопическое вещество

Я1 = 0,55. Ен,у 0,68.

Пример 5. Метиловый эфир карбобензокси-р-алании-тирозил-серил-метионина (Vd).

0,89 r (2,2 ммоль) дмциклогексиламмониевой соли карбобензокси+аланина и 0,93 г (2,06 ммоль) гидрохлорида трнпептида (!Ч) в 20 мл хлористого метилена перемешивают при комнатной температуре 15 мин. Прибавляют 0,54 г (2,2 ммоль) 1-этоксикарбоннл-2-этоксн-1,2-дигидрохинолина и оставляют на ночь. Отфильтровывают осадок гидрохлормда дмциклогекснламина, растворитель упаривают и остаток растворяют в 100 мл и-бутанола. Промывают 5%-ным раствором

NaHCOq (2 х 50 мл), 10%-ным раствором

KHSO4 (2x50 мл) и водой (2х50 мл).

Органический слой упаривают и остаток обрабатывают диэтиловым эфиром. Фильтруют и получают 1,14 г (90,0%) защищенного тетрапептида (Ча ). Т. пл. 102 — 110 С.

= 0,76. Ру=0,37. (а3 =-15,5 . (c а 6 a4

1, диметилформамнд) .

Вычислено, %: С 56,29; Н 6,19; и 9,05.

Сг9НЗЗЙ409$

Найдено, %: С 5628; Н 613, N 9,57.

Пример 6. Метровый эфир карбобенэокси-I -сернл.тирознл-серилметионина (ЧЬ), К раствору 4,5 г (10 ммоль) гидрохлорида трипептида (IV) в 100 мл хлористого метилена прибавляют 2,1 мл триэтиламима и

2,4 г (10 ммоль) карбобензокси-I -серина. Перемешивают при комнатной температуре

15 мин, прибавляют 2,5 r (10 ммоль) 1-этоксикарбонил-2- этокси-1,2-дигидрохинолин и оставляют на ночь. Гелеобразную реакционную смесь упаривают и остаток обрабатывают 150 мл этилацетата. Фильтруют и оса937447 6 док на фильтре промывают несколько раз концентрированными растворами йаНСО„

KHSO4 и водой. Осадок растворяют в минимальном количестве этанола, разбавляют водой и насьпцают хлористым натрием. Фильтруют осадок, тщательно промывают на фильтре водой. Получают 5,1 г (80,5%) защищенного тетрапептида (ЧБ ) т.пл. 163—

167 С, Rf = 0,96, ЙФ = 0,32, (п) 546 !

@ = - 170 (c 1, диметмлформаммд).

Вычислено, %: .С 54,87; N 8,82; H 6,03.

Сг9Нзвй401о$

Найдено, %: С. 55,33; и 8,27; Н 6,13.

Пример 7. Метиловый эфир карбо15 бензокси- D-серил-тирозил-серилметионина (V g) .

Получен аналогично тетрацептиду (V 8 ) (пример 6) из карбобензокси-0-серина и . трипептида (IV ). Выход 63,4%, т.шт. 128—

132 С, Rg = 0,96, В! =0,32, (e(= -7,4

4b (с 1, диметнлформамид).

Вычислено, %: С 54,87; Н 6,03; и 8,82.

Сг 9 Нз в й101 о $

Найдено, %: С 55,17; Н 6,01; и 8,97.

Пример 8. Гидрохлорид этилового эфира норлейцина (Vl).

К 50 мл абсолютного этанола при -10 С и интенсивном перемешнвании прмбавляют по каплям 183 мл (250 ммоль) хлористого тионнла. Поднимают температуры до

30 комнатной и прибавляют 30 r (227 ммоль) норлг пина; Полученную суспензию перемешивают при комнатной температуре !6 ч н прибавляют 350 мл смеси петролейного и дмэтилового эфиров (1:1). Выпавший оса35 док фильтруют и промывают на фильтре этой же смесью (Зх50 мл). Выход 444 r (количественный), т.пл. 129 — 130 С, Я!

= 0,47, Е,; =094. (и) = +. 179 С (с !, этанол).

4о Вычислено, %: С 49,90; Н 9,27; и 7,11.Св 4 вЬг CI

Найдено, %: С 4946; Н 9,34; N 7,33.

Пример 9. Этиловый эфмр о-нитрофенилсульфенило-сермл-норлейцина (ЧИ) .

Получен аналогично защищенному дмпептиду (t) (нример 1) из дмциклогексиламмоимевой соли о-нитрофенилсульфенилсерина и гидрохлорида этилового эфира норлеицииа.

Выход 90,4%, т.пл. 124 — 125, R 0,59;

Rg 0,52. (а) 4 — -77,0 (с 1, этанол).

Вычислено, %: С 51,12; Н 6,31; и 10,52.

С 9НгвйзОв$

Найдено, %: С 52,00; Н 6,21; и 10,77.

Пример 10. Гидрохлорид этилового эфира серия-иорлейцина (Ч!И).

Защитную группу с НФС-дипептида (ЧИ) снимают по описанному методу (нример 2). °

Выход количественный, т.пл. 114-115 С.

937447

Формула изобретения

Составитель В. Волкова

Техред Ж. Кастелевич Корректор H.

Редактор H. Рогулич

Заказ 4370/31 Тираж 445 Подписное

ВНИИПИ Государственною комитета СССР по делам изобретений и открытий

i) 3035, Москва, Ж вЂ” 35, Раушская наб., д. 4/5 I ennàë ИПП "Патент". г:. Ужгород, ул. Проектная, 4

Rf 0,69, ЕИ1в"-0,81. 1а Юоь--9,7 (с 1, этаиол).

Вычислено, %: С 46,72; Н 8,20; N9,91.

С1)H gN O4CI

Найдено, %: С 46,77; Н 8,17; N 9,84.

Пример 11,Этиловыи эфир о-нитрофенилсульфенил-тирозил-серил-норлейцина (IX) .

Получен аналогично защищенному дипептиду 1 иэ дициклогексиламмониевой соли о-нитрофенилсульфенилтирозина и гидрохлори. да трипептида (Vill) с выходом 89%. Т.пл.

73 С с разложением Rf = 0,47, Rf = 0,40, t© у4Ь-+ 65,8 (с 1, этанол).

Вйчислено, %: С 55,63; Н 6,09, И 9,96.

СгбНз4%ЧаОв

Найдено, %: С 56,12; Н 6,03; N 10,12.

Пример 12. Гидрохлорид этилового эфира тирозил-серил-норлейцина (Х).

Защитную группу с трипептида (IV) снимают по описанному методу (пример 21..Выход 91%, т,пл. 145 С с разложением, Rf =

= 0,69, E у 0,77.

Пример 13. Этиловый эфир карбобензокси-саркозил-тирозил-серилнорлейцина (XI) .

Получают аналогично защищенному тетрапептиду (Ч S ) (пример 6) . B mog 82,5%, . т.пл. 123 С с разложением, Rf = 0,48. (а) - 0,5 (с 1, диметилформамид). й.

ычислено, %: С 60,57; Н 6,89; N 9,11. В

Сз Наай40р

Найдено, %: С 60,72", Н 7,19; N 9,31.

Способ получения тирозин- и серинсодержащих пептидов общей формулы

Z — У вЂ” Tyr —.Ser-X-ОЕ, где Х вЂ” Met, Nleu;

Y — Sar; P — Ala; Ser, 0Ser, Š— метил или этил;

Z бензилоксикарбонил, путем последовательного наращивания пептид- ной цепи с С-конца конденсацией защищенных по аминогруппе остатков тироэина и серина с защищенным аминокислотным комS понентом в присутствии конденсирующего средства, с последующим снятием защитных групп обработкой хлористым водородом, при комнатной температуре, о т л и ч а юшийся тем, что, с целью упрощения процесса, улучшения условий труда, новышения качества и расширения ассортимента целевых продуктов, в качестве конденсирующего средства используют 1-этоксикарбонил-2-этокси-1,2-дигидрохинолин, процесс наращивания пептидной цепи проводят в растворе хлористого метилена при комнатной температуре, для защиты амииокислотных остатков тирозина и серина используют о-нитрофенилсульфенильную группу, снятие

20 i о-нитрофенилсульфенильиой защиты проводят раствором эквивалентного количества .хлористого водорода в этаноле в течение

2 — 5 мин, 25 Источники ин о ма ф р ции, принятые во внимание при экспертизе

1. Гудков А. Г. и др. Синтез амида октадекапептида (1 — 18) Р-кортикотропина с использованием трифенилфосфита и имидазола.Синтез декапептида (1 — 10) Р-кортикотропина. Де11 7534 — 73. РЖ "Биофизика", 1974, У 4.

2. Bruce Erickson Nt., Merrifield R.Â.

Acid stability of several Benzylic Protecting.

groups used in solid-phase Peptide аУп Феа а

rearrangement of о — Benzyltyrosine — J. Amer.

Chem. Soc. 1973, 95, Р 1, с. 3750.

3. Патент ФРГ N 2114300, кл. С 07 С 103/52, опублик. 1973.

4. Шредер Э., Любке К. Пептиды. Ч. 1.

М., "Мир", 1967, с. 116.

5. Патент Швейцарии N 497384, кл, С 07 С 103/52, опублик. 1970 (прототип) .