Способ получения алкалоидов метанзинола, метанацина и пропионата метанзинола

Способ получения алкалоидов метанзинола, метанацина и пропионата метанзинола

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

O ll H C A H N K

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

К ПАТЕНТУ, Союз Советских

Социалистических

Республик

< >938?46 (61) Дополнительный к патенту (22) Заявлено 07.10.77(21) 2533351/28-13 (23) Приоритет - (32) 31.03.77 (З1) 37167/77 (Щ Япония

Опубликовано 23. 06.82. Bl0AlltteKb J% 23

Дата опубликования описания 25. 06.82 (51) М. Кл.

С 12 P 1/04//

А 61 К 31/00

С 12 P 1/04j

С 12 R 1/365 (53) УЙМ678. 044. .29(088.8) Государственный авмнтет

СССР оо девам нзвбретеннй и открытий

Иностранцы

Эйдзи Хигасиде, Мицуко Асан и Сеиити Тани (Япония) (72) Авторы изобретения @:

),j;-.

Иностранная фирма

"Такеда Кемикал Индастриз, Лтд.У (Япония) (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АЛКАЛОИДОВ МЕТАНЗИНОЛА, МЕТАНАЦИНА И ПРОПИОНАТА МЕТАНЗИНОЛА

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается получения алкалоидов, Известен способ получения алкалоидов метанзинола, метанацина и пропи5 оната метанзинола путем экстракции целевого продукта органическим растворителем (1).

Однако известный способ дает недостаточно высокий выход алкалоидов, 1о а именно 0,025 мг метанзинола и

0,36 мг метанацина из 1 кг высушенного сырья.

Целью изобретения является повышеwe выхода алкалоидов.

Эта цель достигается тем, что штамм

Nocat diа С- 15003 выращивают в питательной среде, содержащей источники углерода и азота, минеральные соли го и стимуляторы роста, затем отделяют культуральную жидкость от биомассы, подвергают их порознь экстракции и целевой продукт очищают и концентрируют.

Кроме того, экстракцию проводят с помощью несмешивающегося с водой органического растворителя.

Целевой продукт очищают методом хроматографии или осаждения.

Штамм Nocardia С- 15003 выделен из почвы.

Штамм Nocardia С- 15003 депонирован в научно-исследовательском институте ферментов, агентства индустриальной науки и технологии (FERN) под номером 3992, в институте ферментов Осака (IFO) под номером 13726 и в американской коллекции культур (ATCC) под номером 31281.

Культурально-морфологические признаки.

Вегетвтивный мицелий хорошо растет и ветвится на агаре и в жидкой среде.

Гифы имеют 0,8- 1,2 мм в диаметре.

Воздушный мицелий представляет собой извилистые, прямые или свободные спирали.

938746

Рост буйный. Субстратный мицелий от цвета желтой дыни до цвета янтаря, Воздушный мицелий скудный, белый.

Растворимый пигмент отсутствует или он бледно-желтый, рыжевато-коричневый.

Глюкозо-аспарагиновый агар.

Рост средний. Субстратный мицелий от цвета ноготков до желтого, Воздушный мицелий скудный, белый. Растворимый пигмент — желтый..

Крахмальный агар.

Рост средний. Субстратный мицелий цвета слоновой кости. Воздушный мицелий изобильный, цвета слоновой кости.

Растворимый пигмент отсутствует.

Питательный агар.

Рост средний. Субстратный мицелий от цвета слоновой кости до желтого.

Воздушный мицелий скудный, белый.Растворимый пигмент отсутствует.

30

Агар с малатом кальция.

Рост средний. Субстратиый мицелий от цвета слоновой кости до цвета} пшеницы. Воздушный мицелий средний, бело го цвета до цвета слоновой кости.Раст- воримый пигмент отсутствует.

Дрожжевой агар с солодом.

Рост средний. Субстратный мицелий от янтарного до желтого. Воздушный мицелий средний, белый до цвета сло" новой кости ° Растворимый пигмент отсутствует.

Агар с нитратом глицерина.

Рост средний. Субстратный мицелий цвета слоновой кости, коремия подобна образованным телам. Воздушный мицелий средний, белый. Растворимый пигмент отсутствует.

Конидии собраны в цепочки, тогда, как ячеистые суспензии, полученные с поверхностей таких культур, наблюдаемые под микроскопом, содержат много вытянутых элипсоидальных (0,8- 1,2 х х 4,0-6,8 мм ) и элипсоидальных 0 81,2 х 1,0-2,0 мм) тел, похожих на артроспоры.

Штамм хорошо растет в различных средах, причем вегетативный мицелий 10 бесцветный, бледно-желтый в начальных стадиях и светло-желтоватый до желтоватого цвета дубовой коры в последних стадиях. Штамм дает раство. римые пигменты от желтых до желтоватых тонов дубовой коры в различных таксономических средах; ..

Агар нитрата сахарозы.

Агар аспарагина с глицерином.

Рост средний, субстратный мицелий цвета слоновой кости, коремия подобна образованным телам. Воздушный мицелий скудный, белый. Растворимый пигмент отсутствует.

Агар с овсянкой..

Рост средний. Субстратный мицелий от цвета слоновой кости до желтого, коремия подобна образованным телам.

Воздушный мицелий скудный, белый до светло-желтого. Растворимый пигмент отсутствует.

Экстракт пептониых дрожжей в крепком arape.

Рост средний. Субстратный мицелий желтый. Воздушный мицелий отсутствует. Растворимый пигмент желтый.

Тироэиновый агар.

Рост средний. Субстратный мицелий от цвета слоновой кости до цвета желтой дыни. Воздушный мицелий средний, от белого цвета до цвета слоновой кости. Растворимый пигмент - цвет верблюда.

Физиологические характеристики.

Растет при 12-38 С. Оптимальная температура для роста 20-35 С.

Желатину разжижает, крахмал гидролизует.

Молоко пентонизирует, но не коагулирует.

Казеин разлагает.

Нитраты сжижает.

Иеланоидных пигментов не образует.

Тирозин разлагает.

Ксантин и гипоксантин не разлагает.

Толерантность лизима положительная, Толерантность хлорида натрия - 23.

Очень хорошо усваивает ксилозу, глюкозу, фруктозу, маннозу, хорошо . усваивает арабинозу, галактозу, рамнозу, трегалоэу, мелибиозу, маннитин, крахмал.

Слабо усваивает лактоэу, инозитин, сорбитин, глицерин.

Окрашивание по Граму вегетативного мицелия штамма " положительное.

Среда, употребляемая для культивирования штамма, способного производить метанзинол, метанацин или пропионат метанзинола может быть жидкой и твердой. В последнем случае она должна содержать питательную среду, которую штамм может утилизировать, хотя жидкая среда предпочтительна для высокопродуктивных процессов, и, как

9387

5 было найдено, среда является мезоформой, тогда как обнаруженные пятна со.ответствовали галактозе и арабинозе.

Среда содержит источники углерода и азота, которые штаммом У С-15003 5 могут ассимилироваться и дигестироваться, неорганический материал, следы питательной среды и т.д. В качестве источников углерода могут быть глюкоза, лактоза, сахароза, мальтоза, 10 декстрин, крахмал, глицерин, маннитин, сорбитин и т.д., жиры и масла (например, соевое масло, свиное сало, куриный жир и т.д.) и другие. Источниками азота могут быть, например, экстракт мяса, экстракт крахмала, сухой крахмал, соевая мука, злаки, погруженные в жидкость, пептон, казеин, мука из семян хлопка, меласса, мочевина, соли аммония (например, сульфат, хлорид, 20 нитрат, ацетат аммония и т.д.) и дру гие.

Среда может также содержать соли натрия, калия, кальция, магния и т.д., соли железа, марганца, цинка, кобаль- та, никеля и т.д., соли фосфорной борной кислот и т.д., соли органических кислот, такие, как ацетаты и пропионаты.

Среда может также содержать как Зф добавки различные аминокислоты (например, глутаминовую, аспарагиновую кислоты, аланин, глицин лизин мети" ю l

Ьнин, пролин, и т,п.) пептиды например, дипептиды, трипептиды и т.д.) витамины например, В„- В, никотино" вую кислоту, В,, С, . Е и т.д.), нуклеиновые кислоты (например, пурин, пирамидин и их производные и т. д.) .

Для создания определенной величины рНщ среды добавляют органические или неорганические кислоты, щелочи, буферы и т.п. Растворимые количества масел, жиров, поверхностно-активных веществ и т.д. могут также добавляться в качестве анти вспенивателей.

Культивирование проводят при стационарных, колебательных, погружных, аэробных и других условиях.

Для высокопродуктивных процессов погружное аэробное культивирование является предпочтительным. Культивирование зависит от условий и состава среды, штамма, способа культивировани и других факторов ° причем пяедпоч>> тительно проводят инкубирование при

25-30 С с начальной величиной рН в области 7. В промежуточной стадии культивирования желательна температу46 б. ра 23-30 С с начальным рН 6 5"7,5.

Так как время инкубирования меняется в зависимости от упомянутых факторов, желательно продолжать инкубирование до тех пор, пока титр предлагаемого антибиотика не станет максимальным.

При культивировании в условиях аэробного погружения в -жидкую среду необ" ходимый интервал. времени обычно составляет 48- l44 ч. Метанацин, пропионат метанзинола или метанзинол получается и аккумулируется в равнодействующем культивированном бульоне как внеклеточно, так и внутриклеточно.

Ни одно из этих веществ не показывает ясную антибиотическую активность; поэтому они были обнаружены с помощью тонкослойной хроматографии. Ферментный бульон разлагается в клетках,и фильтре с помощью фильтрации или центрифугирования и фильтрат экстрагируют тем же объемом этилацетата. К клеткам добавляют такое же количество

704-ного раствора ацетона в воде, как к фильтрату, и после перемешивания в течение часа при 20 С суспензию фильтруют. Ацетон удаляют из фильтрата и водный фильтрат экстрагируют этилацетатом. Каждый из экстрактов кон центрируют до 1/l00 по объему и анализируют с помощью тонкослойной хроматографии на силикатной гелево-стеклянной пластине (растворитель хлороформметанол 9: 1) . Об активности судят по интенсивности пятен, определяемых иррадиацией с ультрафиолетовым све" том при 2537 А.

Метанацин, пропионат метанзинола или метанзинол, которые, таким обра-; зом получают в культивированном буль оне, дипофильны и нейтральны, они мо-. гут быть легко регенерированы путем сепарации и очистки, которые осуществляют обычно для получения таких микробиологических метаболитов. Например, может быть осуществлена операция, которая использует разницу в растворимости между антибиотиком и примесями, способы, которые используют фракционную абсорбционную эффективность различных абсорбентов, та ких-, как активизированный уголь, мик.ропористые неионные смолы, силикагель, алюминий и т.д., процесс удаления примесей посредством ионообменных смол и т.д. Эти способы могут применяться по отдельности, в комбинации друг с другом, однократно или многократно.

938746

Метанацин, метанзинол или пропионат метанзинола получают в фильтрате, антибиотики отделяют и очищают посредством абсорбентов. Антибиотик получают или непосредственно, или после эк- 5 стракции растворителем в случае фильтрата, или после экстракции растворителем в случае микробных клеток. Экстракция растворителем может быть осуществлена из культивированного бульо- о на для отделения клеток и из фильтрата, полученного после фильтрации, центрифугирования или других процессов.

Чтобы экстрагировать фильтрат и клетки независимо друг от друга могут быть использованы растворители для экстракции фильтрата - водоэмуль- . сионные органические растворители такие, как эфиры жирных кислот, на- 20 пример этилацетат и амилацетат, спирты, например бутанол, галогенированные гидрокарбонаты, например хлороформ, кетоны, например метил-изобутилкетон. 25

Экстракцию производят при рН, близком к нейтральному. Предпочтительно культивированную жидкость, доведенную до рН 7, экстрагировать этилацетатом. Экстракт промывают водой и 30 концентрируют под пониженным давлением. Затем неполярный растворитель такой, как петролейный эфир или гексан добавляют к концентрату, и сырой продукт 1, содержащий активные соеди- 3 нения, регенерируется. Так как на тонкослойной хроматограмме обнаруживается ряд других пятен, кроме метанацина, метанзинола, пропионата метазинола, то продукт 1 подвергают очист-д» ке.

Для очистки используют ряд методов, например абсорбционную хроматографию, с применением одного из общепринятых абсорбентов таких, как сили- 4 кагель, алюминий, макропористая неионная смола. Для очистки сырого про1цукта 1 особенно подходит силикагель

Затем петролейный эфир и гексан используют с добавлением полярных растворителей таких, как этилацетат, ацетон, этэнол или метанол. Силикагель используют как носитель, хроматографическую колонку заполняют последовательно возрастающими отношениями гексана к этилацетату. Пробу исследуют с помощью тонкослойной хроматографии, и фракции, содержащие активные

I ингредиенты, собирают и концентрируют под пониженным давлением. Затем петролейный эфир или гексан добавляют к концентрату, при этом получают сырой продукт П. Так как этот продукт содержит еще примеси, его очищают. На пример, продукт 11 может быть очищен с помощью второй колонки с силикагелем, с использованием дифференциальной системы растворителей. Система растворителей для этой цели может состоять из галогенированного углеводорода такого, как дихлорметан или хлороформ, с добавлением полярного растворителя такого, как спирт, например этанол или метанол, кетон, например ацетон или метилэтилкетон и т.п.

Таким образом выделяют метанацин, метанзинол или пропионат метанзинола.

Чтобы система растворителей для первой и второй колонок с силикагелем могла быть регенерирована, обычные органические растворители при необходимости могут использоваться совместно с упомянутыми.

Когда макропористая абсорбционная смола используется как средство для очистки сырого продукта 11, то очистку метанацина, метанзинола или пропионата метанзинола выполняют в смеси воды с низшим спиртом, низшим кетоном или эфиром. Низшим спиртом может, например, быть метанол, этанол, пропанол или бутанол и низшими кетонами могут быть, например ацетон или метилэтилкетон .. Эфиром может, например, быть этилацетат. В типичной операции сырой продукт 11 растворяют в 603-ном растворе метанола в воде и абсорбируют на колонке D i à i on-HR I Î. Колонку промывают 70/-ным, а затем 903-ным раствором метанола в воде.

Таким образом метанацин, пропионат метанзинола или метанзинол выделяют и з колонки °

Фракции, содержащие указанные компоненты, объединяют и концентрируют под пониженным давлением. К сухому продукту добавляют 5-8 объемов этилацетата, и смесь отстаивают. Затем кристаллы метанацина, пропионата метанзинола и метанзинола отделяют с помощью абсорбентов. Так, используя силикагель или макропористую неионную молу, а в качестве абсорбента — расторители, выделяют описанные соединения. Когда, например, используют силикагель, то-применяют гексан, этил9 938746 1.О. ацетат или смесь хлороформ-метанол, пользовании 60 метанол-вода и 953 при этом выделяют пропионат метанзино- метанол-вода с добавкой 53 хлорида ла и метанацин. После обнаружения с по- натрия метанацин и пропионат метанмощью тонкослойной хроматографии фрак- зинола появляются в упомянутом порядции концентрируют под пониженным дав- ; ке. После взятия пробы и определения пением, и этилацетат добавляют к кон- с помощью тонкослойной хроматографии центрату. Таким образом, соответству- каждую группу активных фракций конющее соединение может быть получено центрируют под пониженным давлением и в виде кристаллов. кристаллизуют из этилацетата. Выделен1о ные кристаллы включают этилацетат как растворитель кристаллизации и после сушки над пятиокисью фосфора при

70 С в течение 8 ч имеют физические и химические свойства, представленные

>s a таблице.

Когда применяют макропористую неионную абсорбентную смолу, то может быть использован растворитель с различным соотношением спирта, кетона или эфира и воды. Например, при исПоказ

Точка плавления, С

235-236

ЕЛО

И.) =121 +

+10 (С=0,25;СНС1) 188-190

172,5- 174

gz<

И) = 313-1d (С=0,22; СНС1э) у" о

i4) = 127" l0 (С=0,35; СНС ly) С пец и фи че с кое вращение

C 59,62

Н 6,93

Найдено,Ф

59,28

59,93

6,82

6,38

4,28

4,32

5,02

6,15

5,57

Вычислено,4

59,95

59,52

6,65

6,60 4, 51

4,96

6,27

5,71

Ультрафиолетовый абсорбционный спектр 0„„(Е) 1740; 1730, 1670; 1580

1715, 1670;

1580

1740 1730;

1670; 1580

Инфракрасный абсорбционный спектр см

С1 5 74

C 59,85

Н 6,48 .ц 4,61

С1 5,84

233 (30330) 233 (30240)

240 Ь1 28240) 240 (S+ 28400)

252 27850 252 27650

280 5680 280 5740

288 5660 288 5710

233 (32750)

244 (Sb 30850)

252 (31650)

281 (5750)

288 (5700) 12

Продолжение таблицы

938746

485; 470, 503;485, 470, 450

Кислота,нейт- Липофил и Липофил и нейт- Липофил и нейтральная или нейтральное ральное вещество ральное вещестосновная вещество во

Цветные реак- Положитель- Положительная Положительная ции (р-ция

Драгендорфа) Положительная

Реакция Бель- Положитель- Положительная штейна ная

Масс-спектр, 545; 485, 559; ш/е 470; 450 450

Приведенные данные элементного анализа, специфического вращения, Уф-, ИК- и масс-спектров находятся в хорошем соответствии с данными для метанацина.

П р и и е р 1. Метанзинол, метанацин и пропионат метанзинола - производные Нокардиа С-15003 (IFO 13726;

FERN 3992; ATCC 31281), выращенные на дрожжевом экстракте солода в arape, используют для прививки 200 ч (по объему) ферментов, содержащих 40 об.ч семян, культивированных в среде (23 глюкозы, 33 раствора крахмала li му1 ки сырых соевых бобов, 14 погруженных в жидкость злаков, 0,5i полипентона, 0,33 НаС1, 0,54 СаСО, рН 7,0).

Культивированную среду инкубируют при 28 С в течение 48 ч до введения

35 в колонку 0,5 об. ч. раствора, полученного таким образом: из колонки пом:.-.щают в 200 об ч. фермента, содержащего

40 об.ч. ферментной среды, состоящей из 5i декстрина, 3i зерна, погруженного в жидкость, 0,14 полипептона и 0,54 СаСО при рН 7,0, и культивируют при 28 С в течение 90 ч, чтобы получить культуру семян.

Методом последовательного разбавле.45 ния, используя в качестве исследуемого организма Тетрахимену пириформис

Фи метанзинолпропионат как стандартный продукт, найдено, что названная культура имеет титр 25 мг/мл. о

Пример 2. 10 об.ч. культуры семян, полученных в примере 1, помещают в 2000 об.ч. фермента, содержащего 50 об.ч. семян, культивированных в среде (такой же, как упомянутая), и инкубируют при 28 С в течение о

48 ч. 500 об. ч культуры переносят в сосуд из стали емкостью 50000 об.ч., содержащий 30000 об.ч. семян, культивированных в среде, и культивируют при 28 С, аэрации (30000 об.ч./мин), перемешивании 1 280 г.р.-m. (1/2ДТ) и внутреннем давлении (1 кг/см ) для получения культуры семян. Эту культуру используют для посева 200000 об.ч. в сосуде из стали, содержащем

100000 об.ч. ферментативной среды, подобной среде, использованной в примере 1, при скорости инокуляции 10 .

Инокуляционную среду инкубируют при

28 С, аэрации (100000 об.ч. /мин ), перемешивании С200 г.р. м .(1/2ДТ)J и внутреннем давлении (1 кг/см ) e течение 90 ч. Проводят ту же операцию, что и в примере 1, Полученная культура имеет титр 25 мг/мл.

К 90000 об.ч. полученной культуры добавляют 2000 ч. Гифло-суперцела P и, после перемешивания, смесь фильтруют на фильтр-прессе, чтобы получить

85000 об.ч. фильтрата и 32000 ч. влажных клеток. Фильтрат 85000 об.ч. перемешивают и экстрагируют 30000 об.ч. этилацетата. Эту операцию повторяют снова. Осадки этилацетата объединяют, промывают дважды 30000 об.ч. воды, сушат путем добавления 500 ч..обезвоженного сульфата натрия и. концентрируют под пониженным давлением до

200 об.ч. Петролейный эфир добавляют к концентрату и проводят. осаждение и фильтрование. Полученный сырой продукт 1 перемешивают со 100 об.ч ° этилацетата, и раствор фильтруют.

Фильтрат смешивают с 10 ч. силикагеля и этилацетат удаляют под пониженным давлением. Остаток помещают на верх колонки с силикагелем 400 об.ч.)

Раствор удаляют 500 об.ч. гексана, 500 об.ч. смеси гексанэтилацетат (3:1), 13

93874

500 об. ч. смеси гексан-этилацетат (1:1), 500 об.ч. смеси гексан-этилацетат (1:3), 500 об.ч. этилацетат,"

1000 об. ч. смеси этилацетат-метанол (50:1) и 1000 об.ч. смеси этилацетатметанол (25:1), собранными во фракции по 100 об.ч.

Одну часть объема каждой фракции концентрируют сушкой, и 0,1 об.ч. этилацетата добавляют в концентрат. о

Смесь дает пятно на расстоянии 2,5 см от дна острия силикагелевой стеклянной пластины и растет, примерно, до

17 см с растворимой системой этилацетат-метанол (19:1) . После этого производят определение в ультрафиоле-, товом свете (2537 A).

Активные фракции Р 25-30 Rf

0,58-0,63 и фракции tf 38-40 Rf

0,25-0,30 собирают и концентрируют под пониженным давлением, примерно до 20 об.ч. К этим концентратам добавляют 150 об.ч. петролейного эфира. для получения 5 ч. сырого продукта 1) и 2 ч. сырого метанзинола. 25

В 10 об.ч. этилацетата растворяют

0,5 ч. полученного сырого продукта 11, и раствор хорошо перемешивают с 4 ч. силикагеля. Этилацетат удаляют под пониженным давлением. Осадок помещают на верх колонки с 300 об.ч. силикагеля, и колонку вначале промывают

500 об.ч. хлороформа и затем обрабатывают 500 об.ч. смеси хлороформ-метанол (50:1), 500 об.ч. смеси хлороформ - метанол (20:1) и 500 об.ч. сме.35 си хлороформ - метанол (10:1). Раствор собирают фракциями по 25 об.ч.

0,5 об.ч. каждой фракции концентрируют при пониженном давлении. К кон40 центрату добавляют 0,05 об.ч. этилацетата, и смесь в виде образца подвергают анализу методом тонкослойной хроматографии (система, хлороформ— метанол 9:1).

Фракцию h" 40, абсорбированную при 45

2537 .А в зоне kg 0,48-0,50, собирают и концентрируют сушкой под пониженным давлением. К осадку добавляют 0,5 об.ч. этилацетата, и смесь отстаивают, затем получают 0,05 ч. смешанных крис50 таллов метанацина и пропионата метанзинола»

0,05 ч. смешанных кристаллов метанацина растворяют в 5 об.ч ° метанола, следовавшего за добавлением О, 1 ч, хлорида натрия и 5 об.ч. воды. Колонку заполняют 200 об.ч. 0iaion HP- 10 и промывают 600 об.ч. 50Й метанол-воды, 6 14 содержащих 54 йаС1. Пробу раствора, при готовленного указанным способом, пропускают через колонку и растворение доводят до конца с использованием

1500 об.ч. 603 метанола - воды, содержащих 53 йаС:1 и 1500 об;ч..95ь метанола - воды. Раствор собирают в фракции по 15 об. ч., и каждую фракцию и сследуют тонкослойной хроматографией, Фракции 130- 135 содержат метаноцин, и фракции 138- 142 содержат пропионат метанзинола.

Каждую группу фракций концентрируют и растворяют добавлением 30 мл воды и 50 мл этилацетата. Раствор перемешивают в разделительйой воронке, водный слой отделяют, и после двухкратной промывки 30 мл воды осадок этилацетата высушивают над безводным сульфатом натрия, концентрируют и отстаивают. Описанным способом получают

Кристаллы из каждой группы фракций.

Кристаллы собирают с помощью фильтрации и сушки. Содержание метанацина

0,013 ч., пропионата метанзинола0,025 ч.

В 3 об.ч. этилацетата растворяют

0,2 ч. сырого метанзинола, полученного описанным способом, и раствор хорошо перемешивают с 0,5 ч. силикагеля °

Этилацетат удаляют под пониженным давлением. Осадок помещают на верх колонки с 80 об.ч. силикагеля, и колонку сначала промывают 150 об.ч. хлороформа и затем 150 об.ч ° смеси хлороформ-метанол (50:1), 150 об.ч. смеси хлороформ-метанол (20:1) и

300 о6.ч. смеси хлороформ-метанол (10:1). Раствор собирают во фракции по 10 об.ч.

0,5 об.ч. каждой фракции концентрируют под пониженным давлением. К концентрату добавляют 0,05 об.ч. этилацетата, и смесь подвергают анализу с тонкослойной хроматографии (растворяющая система. хлороформ - метанол

9:1) °

Фракции N 50-52 абсорбируют при

2537 А в зоне 0,33-0,38, собирают и концентрируют путем сушки под пониженным давлением. К осадку добавляют

0,5 об.ч. этилацетата, и смесь отстаивают, в результате чего получают

20 ч. кристаллов метанзинола.

fl р и м е р 3. Путем перемешивания 32000 ч. клеток, полученных в примере 2, экстрагируют 50000 об.ч.

9387

704 ацетона - воды в течение 3 ч и затем фильтруют на фильтр-прессе.

Экстракцию проводят 50000 об.ч. 704 ацетона — воды, и снова повторяют фильтрацию, Фильтрат соединяют и ацетон удаляют концентрированием под пониженным давлением. Водную систему пропускают через колонку с 5000 об.ч, 0iàion HP- 10. Колонку промывают

20000 об.ч. воды и 503-ным водным 1о раствором метанола, затем 15000 об.ч.

904-ного раствора метанола в воде.

Раствор концентрируют под пониженным давлением до 3000 об.ч., встряхивают с 3000 об.ч. воды и 3000 об.ч, 15 этилацетата. Эту же операцию повторяют снова. Слои этилацетата соединяют, промывают водой, сушат путем добавления обезвоженного сульфата натрия и концентрируют под пониженным давлени- zo ем до 200 об.ч. Последующим добавлением петролейного эфира осадок отделяют фильтрованием (280 ч.) . Упомянутый сырой продукт 1 очищают с помощью колонки силикагеля так же, как в при- у мере 1, с выделением 1,0 ч. сырого продукта 11 и 0,5 ч. сырого метанзинола.

Пример 4. 1000 об.ч. культуры примера 2 помещают в стальной со-. 3O суд емкостью- 200000 об.ч., содержащий 100000 об.ч. культуры семян в среде. Среду инкубируют при 28 С при аэрации (100000 об.ч./мин) и перемешивании (200 .г. р.т.) в течение 48 ч

35 до получения культуры семян. Эту культуру семян помещают в стальной сосуд емкостью 2000000 об. ч., содержащий 1000000 об.ч. ферментативной среды, так же, как в примере 1, при скорости трансплантации 103. Культивирование проводят при 28 С в условиях аэрации (1000000 об,ч./мин1, перемешивания (120 г.р. и 1/3ДТ ) и внутреннего давления (1 кг/см )a течение 90 часов, Культура имеет титр

45 . 20 мг/мл. Далее проводят те же операции, что и в примере 1. К 900000 об. ч. упомянутой культуры добавляют

900000 об.ч. ацетона и после часа

46 i6 перемешивания 20000 ч. Hyf 1osuper,el

Johnes. Смесь затем перемешивают и фильтруют на прессфильтре. К

1700000 o6,ч. результирующего фильтрата добавляют 500000 об.ч. воды и в РодЫelniak смесь экстрагируют с

1000000 об. ч. этилацетата. Слой этилацетата промывают водой, сушат путем добавления обезвоженного сульфата натрия и концентрируют при пониженном давлении. К концентрату добавляют петролейный эфир, и осадок выделяют фильтрованием и сушкой. В результате этой операции получают 680 ч. сырого продукта 1. Затем, как в примерах 2 и 3 этот сырой продукт очищают до получения 1,l,÷. метанацина, 2,2 ч. пропионата метанзинола и 0,1 ч. метанзинола.

Предлагаемый способ позволяет увеличить выход алкалоидов.

Формула и зобретения

1. Способ получения алкалоидов метанзинола, метанацина и пропионата метанзинола путем экстракции целевого продукта органическим растворителем, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода алкалоидов, штамм Nocardia С- 15003 выращивают в питательной среде, содержащей источники углерода и азота, минеральные соли и стимуляторы роста, затем отделяют культуральную жидкость от биомассы, подвергают их порознь экстракции и целевой продукт очищают и концентрируют.

2. Способ по и. 1, о т л и ч а— ю шийся тем, что экстракцию проводят с помощью несмешивающегося

:с водой органического растворителя.

3. Способ по и. 1, о т л и ч а ю шийся тем, что целевой продукт очищают методом хроматографии или осаждения.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Kipchan et al - Journal of the

American Chemistry Society 1975,97

5294.

Составитель С. Малютина

«Редактор H. егоpoaa Техред 3. Палий Корректор В. Бутяга

Заказ 4495/81 Тираж 505 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва M-35, Раушская наб. д. 4/5 филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4