Гептапептид в качестве стимулятора памяти пролонгированного действия

Гептапептид в качестве стимулятора памяти пролонгированного действия

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Союз Советских

Социапистических

Республик

ОП ИСАКИЯ

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

< >939440 (61) Дополнительное к авт. свнд-ву (22) Заявлено 06. 01. 81 (21) 3233411/23-04 с присоединением заявки № (23)приоритетОпубликовано 30. 06. 82. Бюллетень №24

Дата опубликования описания 30 .06 . 82 (5l)M. Кл, С 07 С 103/52

A 61 К 37/02

3Ьсударствеиный комитет

СССР ве деИаи изобретений н открытий (53) УД 1 547. 964.

° 4(088,8) М.A.Ïoíîìàðåâà-Степная, В Н.НЙавибатько, !

A. А. Каменский н.,Л. В.Янгана ца

Институт молекулярной гендти ки ордена Ленина, ордена Октябрьской P.

Трудового Красного Знамени госуд им.M. В.Ломоносова

И,,Ашмарин, ".: 1 (72) Авторы изобретения

I овский ена (7l) Заявители верситет (54) ГЕПТАПЕПТИД В КАЧЕСТВЕ СТИМУЛЯТОРА

ПАМЯТИ ПРОЛОНГИРОВАННОГО ДЕЙСТВИЯ

Изобретение относится к новому химическому соединению, конкретнее к гептапептиду формулы

Met-G Ru-Н!s-Phe-Р ro-G Py-Pro, (1 ) являющемуся стимулятором памяти пролонгированного действия.

Известен гептапептид - фрагмент

АКТГ,1„, 1формулы

1et-GPu"H1s-Phe-Arg-Trp-GPy, обладающий психофармокологической

10 активностью, в частности способност ью стимулировать память f1).

Известен ряд аналогов фрагмента

АКГТ1,,(О, обладающих более высокой

AG сравнению с нативным Фрагментом

АКТГ, о психофармакологической активностью (?).

К недостаткам известных соединений следует отнести быструю потерю биологической активности за счет ферментативной деградации.

Цель изобретения - расширение арсенала стимулирующих память средств, 2 обладающих пролонгированным действием.

Поставленная цель достигается гептапептидом формулы

t1e t-G1u-Hi s-Phe-Pro- Г1у-Pro.

Синтез гептапептида формулы (I ) осуществляют известным методом (3), путем ступенчато ого наращивания пеп-., тидной цепи, начиная с С-концевого дипептида с помощью дициклогексилкарбодиимида с добавкой оксибензотриазола с последующим отщеплением защитных групп трансферным гидрированием 1,4-циклогексадиеном в присутствии палладиевой черни.

Принятые сокращения:

Вос - трет-бутилоксикарбонильная группа

BzP - бензильная группа

БТ - оксибенз1риазол

ДЦГК - дициклогексилкарбодиимид

ДЦМ - дициклогексилмочевина

ДСНА — дициклогексиламмониевая соль

ТГФ - тетрагидрофуран

939440, ТФУ - трифторуксусная кислота

ТФА - трифторацетат

ТЭА - триэтиламин

ЦГД - 1,4-циклогексадиен

ЭА — этилацетат S

Конт рол ь з а си н т е зом пе пти до в проводят на пластинках марки "Силуфол" при опрыскивании раствором нингидрина или толидиновым реагентом, после обработки хлором в сис- 10 темах растворителей 1) н-бутанол: уксусная кислота: вода (5: 1: 2);

2 ) хлороформ:метанол (14:1 ); 3) н-бутанол:уксусная кислот а: пиридин: вода (30: 6: 20: 24 ); 4 ) хлороформ: мета- 15 нол: аммиак (10: 5: 1); 5) изобутанол: ацетон: 123-ный аммиак (5: 3: 2); 6) изопропанол: муравьиная кислота: вода (20:

:1:5).

Все растворители абсолютируют со" 20 ответствующим образом. Точки плавления не корректируют, Целевой продукт после отщепления защитных групп подвергают кислотному расщеплению кипячением в 6н. НСР s течение гз

48 ч и затем исследуют в систе- ме растворителей 5 и 6 двухмерной хроматографией (f!ngerprint). б

Продукт гидролиза соответствует

30 содержанию всех аминокислот, входящих в состав пептида. Оптическое вращение измеряют на цифровом поляриметре марки "Perkin-E Imer".

Пример 1. Получение гептапептида формулы (7).

Бензиловый эфир М-трет-бутилоксикарбонилпропилпролина

Boc-Pro-GIy-Pro-0BzP.

675 мг (3, 14 ммол ь) Вос-P ro-ОН

40 растворяю в 10 мл ТГФ, добавляют

475 мг (3,14 ммоль) БТ, охлаждают до 0 С и добавляют 710 мг (3,42 ммоль) ДЦГК в 5 мл ТГФ. После перемешивания в течение 1 ч при ком45 натнои температуре к реакционной смеси добавляют четырьмя порциями в течение 2 ч раствор бензилового эфира ТФР Н-GIу-Pro (3,14 ммоль) и 0,4!! мл (3,14 ммоль) ТЭА в 10 мл

ТГФ. Реакционную смесь оставляют на

3 сут при комнатной температуре, затем отфильтровывают ДЦМ, раствор упаривают в вакууме, остаток растворяют в ЭА. Этилацетатный раствор промывают 0,1 M раствором НСР, НпО, 53-ным раствором МаНСО, Н О, а затем высушивают над MgS04 и упариваат в вакууме. Оставшееся масло рас4 тирают с абс.эфиром, при этом постепенно отделяется порошкообразный осадок, который отфильтровывают и высушивают в вакууме.

Выход 750 мг (534). Т.пл. 120122 С. и =0,65 (1); 0,74 (2).

II. Бензиловый эфир N-трет-бутил-. оксикарбонилгистидилфенилаланина

Вос-His-Phe-ОВгР синтезируют из

I0 ммоль N-трет-бутилоксикарбонилгистидина и 10 ммоль и -толуолсульфоната бензилового эфира фенилаланина методом, описанным на j стадии с выходом 88> Т.пл. 164-166 С.

Rf 0,836 (3); 0,43 (1), 1 !

И, N-трет-бутилоксикарбонилгистидилфенилаланин

Вос-His-Phe-OH, 350 мг (0,76 ммоль) Вос-His-Phe-0BzP растворяют в 5 мл метанола, добавляют 0,5 мл уксусной кислоты, катализатор - палладиевая чернь и гидрируют при комнатной температуре в течение 10 ч. После отфильтровывания катализатора и многократного промывания метанолом раствор упаривают в вакууме и остаток обрабатывают эфиром. Отделившийся осадок отфильтровывают и высушивают в вакууме.

Выход 270 мг (763). Т.пл. 173174 С. Ry=O 35 (1). !

Ч . Бензиловый эфир N-трет-бутилоксикарбонилгистидил-фенилаланилпропилглицилпролина

Вос-His-Phe-Pro-БЕу-Pro-0BzP.

500 мл Вос-P ro-G Ey-P го-OBz 0 суспензируют в 3 мл СНпС Р, добавляют 3 мл ТФУ и оставляют на 30 мин при комнатной температуре, упаривают и к оставшемуся маслу добавляют абс.эфир. Постепенно при выдерживании в холодильнике отделяется осадок. Эфирный слой сливают и промывают осадок несколько раз декантацией абс.эфиром. Высушивают в ва-. куум-эксикаторе, Выход количественный. Р =0,01 (1); 0,085 (2).

Из 240 мг (0,51 ммоль) полученного трифторацетата бензилового эфира глицилпролина и 250 мг (0,62 ммоль)

М-трет-бутилоксикарбонилгистидилфенилаланина методом, описанным на стадии 1, синтезирован бензиловый эфир М-трет-бутилоксикарбонилгистидилфенилаланилпропилглицилпролина с выходом 723. Т.пл . 160- 1620С.

Ну=0,27 (1); 0,08 (2).

9394 >0

Бензиловый эфир И-трет-бутилокси карбонил-) бензил глут амил ги стидилфенилаланилпролил глицин пролина.

Вос-G tu- (OBz P) -Н i s-Phe-Pro-G Py«Р.го 082 Ре

260 мг (0,50 ммоль) Вос-GPu(OBzR)-ОН 0СНА суспензируют в 10 мл эфира, добавляют 4 мл 0,2 н. H>ISO и многократно встряхивают в делитель->0 ной воронке для удаления ДСНА. Boc-GPu(08zF)-OH при этом растворяется в эфире. Эфирный слой отделяют от водного и многократно промывают .водой до рН 7. После высушивания . 15 над MgSO эФирный раствор упаривают в вакууме и оставшееся масло высушивают в вакуум-эксикаторе.

Вос-His-Phe-Pro-GPy-Рro-08z2 суспенэируют в 3 мл СН, СЙ, добав- го ляют 3 мл ТФУ, оставляют на 30 мин при комнатной температуре и упаривают в вакууме. К остатку добавляют абс. эфир и г>эмещают в холодильник. Выпавший осадок отделяют от эфирного слоя, несколько раэ промывают абс. эфиром и сушат в вакууме.

В итоге с выходом 913 получают

2ТФА-Н-Hi s -Phe-P ro-G Ey-P ro-08z P. й4 — — О, 10 (1); О, 06 (2) .

Далее Вос-G Pu(OB z P) -ÎH раст воряют в ТГФ, добавляют 50 мг (0,37 ммоль1

БТ, охлаждают до ООС, прибавляют

80 мг (0,39 ммоль) ДЦГК в 3 мл ТГФ и перемешивают в течение 1 ч при комнатной температуре. Далее прибавляют четырьмя порциями в течение

2 ч 300 мг (0,31 ммоль) 2ТФА-Н-His- p

-Phe-Pro-Г>Ey-Pro-ОВ P. Реакционную смесь перемешивают 3 сут при комнатной температуре и обрабатывают аналогично стадии I

Выход 250 мг (76,53). Т.пл. 168170ОС. Rg=0>30 (1)1 0,01 (2).

4. Бензиловый эфир М-трет-бутилоксикарбонилметионил-f-бенэилглутамилгистидилфенилаланилпролилглицилпролина

Bос-Met-G Pu (08 z P) -H i s-Phe-Рго-Глу-Pro-OBzi, Получают из Вос-Met-OH 0CHA и

Вос-С Pu(OB z Р) -Hi s-Phe-P ro-G Ey-P ro-"

-OBz E методом, описанным на стадии

У, с выходом 584 °

Т. пл. 98- 1 ООО С . и =0, 84 (3);

0,79 (4); (dj I1 -50,0ОС=0,12; АсОН).

Ill .. Н-т рет-бутилоксикарбонилметионилглут амилгист идилфенилала" н ил п роли л п роли н

Вос-Me t-G Fu-H i s-Phe.-Pro-G Py-Pro-ОН.

75 мг (0,062 ммоль) Вос-Met-O Py (OBz Р) "Hi s-Phe-Pro-G Py-Pro-OBz Г кипятят s 0,5 мл этанола и 0,5 мл

1,4-циклогексилдиена в присутствии

15 мг палладиевой черни в течение

2 ч. Затем катализатор отфильтровы- вают и многократно промывают этанолом. Объединенный фильтрат упаривают. Остаток растворяют .в 0,5 мл абс. метанола и осаждают добавлением абс. эфира.

Выход 48 мг (76 ); Ry=0,26 (1);

0,96 (4).

VIA. Метионилглутамилгистидилфенил«аланилпролилглицилпролин

Н-Met-0 Ь-Hi s-Phe-P ro-Г> Py-Pro-OH.

48 мг Вос-Мвй-Gtu-His-Phe-Pro-В Ру-P ro-OH раст воряют в О, 5 мл

1 н НСР/АсОН и выдерживают при комнатной температуре 30 мин. Затем добавляют абс.эфир, выпавший осадок отфильтровывают, промывают несколько раз абс. эфиром и высушивают в вакууме. В итоге получают 25 мг (57ь)

Н-Het-GGO-Hie-PHe-Pro-G>y-Pro-ОН.

Ву-0,09 (1); 0,94 (4); fd J Ç=

=-67,550 (С=0,34; AcOH) . Аминокислотный анализ: Met 0,93 (1,0), GPu 1,00 (1,0); His 0,96 (1,0); Phe 1,00 (1,0); Pro 1,80 (2,0); GPy 1,10 (1,О).

Проводили сравнение природного

Фрагмента ЛКТГ,1ои гептапептида формулы (I) по способности стимулировать память у животных. Исследуемые пептиды вводили внутрибрюшинно в водном растворе самцам нелинейных белых крыс весом 150-200 r за 30 мин и за 1 ч до момента обучения. Конт" рольным животным вводили внутрибрюшинно дистиллированную воду. Обучение крыс проводили в Т-образном лабиринте с пищевым подкреплением: крыс в течение 4 дн обучали находить пищу .в

Т-образном лабиринте. При этом фиксировали время, необходимое для поисков пищи и скорость обучения животных.

Полученные результаты приведены 8 таблице.

Количество невыполненных реакций у крыс, которым вводили эа час до обучения НяО, АКТГ4 <о 0,015 мг/кг, и гептапептид формулы $I) 0,015 мг/кг.

939440

Невыполненные реакции, 4 при введении

День обучения

Гептапептид формулы (?) Н О

АКТГд „о

46

50

22

59

37

Составитель О.Галкин

Техред Jf. Пекарь Корректор А. Гриценко

Редактор Л.Пчелинская

Заказ 4587/35 Тираж 445 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Иосква, Ж-35, Раушская наб., д.4/5

Филиал ППП "Патент", г.ужгород, ул,Проектная,4

Из т аблицы видно, что внут рибрюяи нное введение гепт апептида формулы (I) в дозе 0,015 мг/кг за 1 ч до обучения достоверно снижает число невыполненных реакций, т.е. ускоряет обучение. Природный пептид

ЯКТГ g fg при введении через t u сказался неэффекти вным.

Таким образом, гептапептид формулы (I) обладает пролонгированным действием при стимуляции памяти животных по сравнению с природным фрагментом АК1 Г . формула изобретения

Гептапептид формулы

Met-G Pu-Hi s- Phe-Р го-G By-Pro в качестве стимулятора памяти пролонгированного действия.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

zо

Ашмарин И,П., Еропкин И.f0., Ковалева Т.А., Рожанец В. В. Оли гопептиды мозга - анальгетики, стимуляторы памяти и сна. - Молекулярная биология", т.12, У" 5, с.965-979 (1978), 2. Патент США 4" 3853836, кл. 260/112.5 R, 1974.

3. Химия полипептидов. Под. Реи.

П.Катсояниса. И., нВ р", 1977 с.39.