Способ очистки протеолитических ферментов

Способ очистки протеолитических ферментов

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

liCnOCOB ОЧИСТКИ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ путем биоспецифической сорбции ферментсодержащих растворов при рН, большем или равном 1,8, на нерастворимом носителе, который предварительно вводят во взаимодействие с раствором к нденсируюсцего агента и лигандом, с последующей десорбцией сорбированных ферментов солевыми буферами или солевыми растворами органических растворителей, отличающийся тем, что, с целью повышения эффективности процесса за счет увеличения выхода ферментов высокой степени чистоты и активности, а также удешевления и упрощения процесса, в качестве носителя используют аминопроизводное кремнеземсодержащего материала, а процесс ведут при рН 1,8-9,5 в зависимости от рН-оптимума фермента, 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве носителя используют аминосилохром. 3.Способ по п. 1, отлича ющ и и с я тем, что в качестве кон{денсирующего агента используют (зохинон, или карбодиимид, или гексаметилендиизоцианат . 4.Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве лиганда используют п-(со-аминометил) производное фенилборной кислоты или антибиоэик-полйпептид. 5.Способ по п. 4, отличающийся тем, что, в качестве антибиотика используют бацитрацин, или бациллихин, или грамицидин С. 6.Способ по пп. 1-5, отличающийся тем, что при очистке карбоксильных протеиназ в качестS ве лиганда используют антибиотик Л полипептид, а процесс ведут при рН 1,8-5,0. 7.Способ по пп. 1-5, отличающийся тем, что при очистке сериновых протеиназ в качестве лиганда используют антибиотик - поли| пептид, а процесс ведут при рН 6,0|8 ,5. 8.Способ по пп. 1-4, о т л ичающийс я тем, что при очистке сериновых протеиназ в качестве лиганда используют п- (со-аминометил) фенилборную кислоту, а процесс ведут при рН 6,0-9,5. 9.Способ по п. 8, отличающийся тем, что процесс осуществляют при рН 7-8. 10.Способ по пп. 1-4 и 7-9, отличающийся тем, что сорбцию сериновых протеиназ ведут в присутствии глицерина, а десорбцию - в присутствии растворов многоатомных спиртов, например пентаэритрита .

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН (19) (И) 1(5)) С 12 N 9/50

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ .Н АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ L

1 () ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 2649412/23-04 (22) 25.07.78 (46) 07.01.84. Бюл. Р 1 (72) В.М. Степанов, Г.Н. Руденская, В.Х. Акпаров и A.Â. Гайда (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов и Московский ордена Ленина, ордена

Трудового Красного Знамени и ордена

Октябрьской Революции государственный университет им. М.В. Ломоносова (53) 577 . 15 .04 . 66 ° 07 (088 .8) (56) 1. Авторское свидетельство СССР го заявке )) 2370306/04, кл. С 07 G 7/02, 1976, непубликуемое . (прототип). (54) (57) 1,СПОСОБ ОЧИСТКИ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ путем биоспецифической сорбции ферментсодержащих растворов при рН, большем или равном

1,8, на нерастворимом носителе, который предварительно вводят во взаимодействие с раствором конденсирующе"

ro агента и лигандом, с последующей десорбцией сорбированных ферментов солевыми буферами или солевыми растворами органических растворителей, отличающийся тем, что, с целью повышения эффективности процесса эа счет увеличения выхода ферментов высокой степени чистоты и активности, а также удешевления и упрощения процесса, в качестве носителя используют аминопроизводное кремнеземсодержащего материала, а процесс ведут при рН 1,8-9,5 в зависимости от рН-оптимума фермента, 2. Способ по и. 1, о т л и ч а юшийся тем, что в качестве носителя используют аминосилохром.

3. Способ поп. 1, о тл ич аюшийся тем, что в качестве кон;денсирующего агента используют п=бен(зохинон, или карбодиимид, или гексаметилендиизоцианат.

4. Способ по г.. 1, о т л и ч а юшийся тем, что в качестве лиганда используют п-((.)-аминометил) производное фенилборной кислоты или антибиоэик-полипептид.

5 ° Способ по и. 4, о т л и ч а юшийся тем, что, в качестве антибиотика используют бацитрацин, или бациллихин, или грамицидин С.

6. Способ по пп. 1-5, о т л ич а ю шийся тем, что при очистке карбоксильных протеиназ в качест- Q ве лиганда используют антибиотикполипептид, а процесс ведут при рН 1,8-5,0.

7. Способ по пп. 1-5, о т л ич а ю шийся тем, что при очистке сериновых протеиназ в качестве лиганда используют антибиотик — поли пептид, а процесс ведут при рН 6,018i5.

8. Способ по пп. 1-4, о т л ич а ю шийся тем, что при,очистке сериновых протеинаэ в качестве лиганда используют п-((,)-аминометил) фенилборную кислоту, а процесс ведут при рН 6,0-9,5.

9. Способ по п. 8, о т л и ч а юшийся тем, что процесс осуществляют при рН 7-8.

10. Способ по пп ° 1-4 и 7-9, отличающийся тем, что сорбцию сериновых протеиназ ведут в присутствии глицерина, а десорбцию — в присутствии растворов многоатомных спиртов, например пентаэритрита.

942427 йа основе сефарозы, содержат от 0,8 до 8 мкмоль лиганда на 1 мл влажного сорбента. Такая концентрация лиганда не позволяет добиться максимальной сорбции фермента на единицу объема колонки. Для обеспечения более эффективного процесса очистки в ряде случаев полезно увеличить концентрацию лиганда, что позволяет увеличить выход ферментов по активности и чистоте.

Целью изобретения является повышение эффективности процесса за счет

Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к области получения высокоочищенных и высокоактивных ферментных препаратов, которые могут быть использованы в медицине, биохимии и пищевой промышленности, в производстве моющих средств, а также для исследовательских целей.

Наиболее перспективным для избирательной очистки ферментов является метод аффинной хроматографии, основанный на сродстве ферментов к специфическим аналогам субстрата или ингибиторам, ковалентно связанным с нерастворимым носителем, что позволяет разделять ферменты на основе их биологической специфичности, а потому достигать более высокой степени очистки по сравнению с другими видами хроматографической техники.

Наиболее широко выделение Ферментов биоспецифической хроматографией ведут с помощью биоспецифических сорбентов, представляющих собой нерастворимые носители — производные агарозы, активированные бромцианом и ковалентно связанные с лигандами — веществами специфическими для данного класса Ферментов.

Известен способ очистки протеолитических ферментов путем биоспецифической сорбции ферментных растворов на нерастворимом носителе,, представляющем собой производное агарозы сефарозу 4В который ковалентно связан с лигандом посредством конденсирующего агента (бромциана) с последующей десорбцией сорбированных ферментов, причем в качестве лиганда используют антибиотик-полипептидбацитрацин, являющийся неконкурентным ингибитором ряда протеиназ.

Очистку проводят при рН 1,8-8,0.

Десорбцию осуществляют солевыми буферами или буферами с добавлением

I органических растворителей (1) .

Выход ферментов по активности достигает 86%, степень очистки 295 раз в зависимости от чистоты исходного препарата.

Данный способ обладает рядом ненестатков.

Применяемая сефароза 4В является

t импортным дорогостоящим продуктом.

Кроме того, недостаточная механическая прочность производных агарозы и способность их разрушаться под воздействием некоторых ферментов, сопут" ствующих очищаемым протеиназам, огра ничивает воэможности применения сефарозы. Недостатком данного способа является также применение высокотоксичного бромциана. увеличения выхода ферментов высокой степени чистоты и активности, а также удешевление и упрощение процесса.

Указанная цель достигается предлагаемым способом очистки протеолитических ферментов путем сорбции ферментсодержащих растворов при рН, большем или равном 1,8, на нераство-. римом носителе, который предваритель20 но вводят во взаимодействие с раствором конденсирующего агента и лигандом, и десорбции, сорбированных ферментов солевыми буферами или солевыми растворами органических растворителей, причем в качестве носителя используют аминопроизводное кремнеэемсодеряащего материала, а процесс ведут при рН 1,8-9,5 в зависимости от рН-оптимума фермента.

Кроме того, в качестве носителя используют аминопроиэводный кремнеэемсодержащий материал. Процесс ведут при рН 1,8-9,5. В качестве носителя предпочтительно используют аминопроизводные макропористого микросферического кремнезема типа Поросил или Силохром (обычно. — аминосилохром), Силохромы выпускаются в больших количествах отечественной промышленностью и являются значительно более дешевым продуктом чем сефароэа.

Используемый в способе аминосило хром характеризуется высоким. содержанием реакционноспособных аминогрупп, что дает возможность повысить содержание лигандов от б до 100 мк60.моль на 1 мл влажного сорбента, а также обладает лучшими по сравнению с сефарозой гидродинамическими свойствами, что позволяет увеличить скорость и производительность процесса

Указанный способ не обеспечивает достаточной эффективности процесса очистки, так как сорбенты,, полученны очистки, имеющие внутри зерен крупные поры

40 более или менее однородного размера.

Они отличаются высокой механической и термической стабильностью. Кроме того, важным преимуществом макропористых кремнеземов по сравнению с

45 другими материалами того же назначения, например сефарозой, является высокая химическая чистота, строго контролируемый размер пор, возможность достижения больших скоростей

50 фильтрации и легкость стерилизации.

942427

Обгнб

О билохрпи

I I

О-Й-(."Н,-CH (."Н,-ЖНр+ I 1+ОН,-(dN-ОО _#_H) 0

Обгн5

Х НАО-h< -Об Я

А нтиоиоп икН С-б=О пол ипепжио (g)> (бн )

2 ,о

NH н, - =о но- )- он

+ КН

NH2 OH Б(ОН)2 г

R-áí

+ +г I

К=1=я-сН -сН -СН -ж О г

d=G

ОН б,н, NH

l

0-$i — OH — 4Hs-1Н, -3Н d — 1H,- ОН,-" -_#_H -gH 3 «3(QHj

)) tl

0Н О О

В качестве конденсирующих агентов для связи носителя с лигандом обычно используют п-бензохинон, или карбодиимид, или гексаметилендиизоцианат.

В качестве лиганда используют обычно п-(4)-аминометил)-фенилборную

Антибиотики-полипептиды, используемые в качестве лигандов, являются ингибиторами карбоксильных протеиназ. Этим обусловлено специфическое взаимодействие сорбента с протеолитическими ферментами различных классов. Присутствие в молекулах антибиотиков D-аминокислот и характерные для циклопептидов особенности пространственной структуры препятствуют их расщеплению ферментами.

Бацитрацин представляет собой природный циклододекапептид, содержащий три D-аминокислоты. Бациллихин - отечественный препарат, аналогичный бацитрацину, выпускается в больших количествах промышленностью для использования в животноводстве.

В молекуле другого природного циклододекапептида, грамицидина С, преобладают гидрофобные аминокислоты. В отличие от бацитрацина, в составе которого имеются дикарбоновые аминокислоты, а грамицидине С содержится больше нейтральных аминокислот, а также диаминокислота — орнитин. Тонкие различия в строении молекул лигандов усиливают специфичность сорбентон к различным протеиназам. В ряде случаев грамицидин-С-силохром и бацитрацин-силохром являются взаимодополняющими сорбентами: фермент, который не сорбируется на одном иэ них, можно успешно хроматографировать на другом. Эти свойства можно кислоту или антибиотик-полипептид: бацитрацин, бациллихин, грамицидин С.

Конденсация носителя с лигандом с помощью конденсирующего агента иллюстрируется следующей схемой

1 использовать для разделения смеси, содержащей два протеолитических фермента.

Используемая в качестве лиганда и-(CJ-аминометил) фенилборная кислота обладает групповой специфичностью по отношению к классу сериновых про теиназ, образуя лабильные комплексы

40 с функциональными группами активного центра фермента.

При очистке карбоксильных протеийаз обычно .используют носители, содержащие в качестве лиганда антибиотик-полипептид, а процесс ведут при.

- pH 1с8-5,0.

При очистке сериновых протеинаэ обычно в одном случае используют носители, содержащие в качестве лиганда антибиотик-полипептид, и процесс ведут при рИ 6,0-8,5, в другом случае используют носители, содержащие в качестве лиганда п-(63-аминометил) фенилборную кислоту, и процесс ведут при рН 6-9,5, предпочтительно 7-8.

Сорбцию сериновых протеиназ предпочтительно ведут при дополнительном присутствии глицерина, а десорбцию— в присутствии раствора многоатомных

60 спиртов, например пентаэритрита.

Важным преимуществом описываемого способа является возможность его применения для очистки препаратов ферментов, содержащих в качестве при 5 месей большое количество целлюлаэ, 942427

Для десорбция используют растворы солей различной концентрации. B 60 тех случаях, когда фермент связывается с сорбентом настолько прочно, что его не удается элюировать, применяют растворы солей, к последним добавляют органи еские растворителя, декстраназ и Ферментов, способных гидролизовать агарозу. Неорганические носители на основе макропористого кремнезема устойчивы к действию

Ферментов и бактерий. Описываемый способ позволяет исключить применение высокотоксичного бромциана, заменить дорогостоящий импортный продукт сефарозу отечественными но< ителями, повысить эффективность процесса очистки.

Описываемый способ позволяет очи.— щать с выходом 75-100-. различные протеолитические ферменты с увеличением активности в 1,5-100 раз в зависимости от чистоты исходного препарата.

Способ особенно эффективен при извлечении ферментов непосредственно из культуральной жидкости, содержащей окрашенные примеси. В таких случаях выделяются практически чистые ферменты, причем вследcòâèå высокой избирательности сорбентов значительный эффект достигается в одностадийном процессе очистки. г5

Кроме того, описываемые биоспецифические сорбенты могут быть применены для работы с растворами в широком диапазоне рН (1,8-9,5) . Это дает возможность использовать их для выделения протеолятических ферментов различных классоь, включая карбоксильные, сериновые, тиоловые, металлопротеяназы и экзопептидазы.

Способ осуществляют следующим образом. 35

Для синтеза носителей, необходимых для очистки требуемого фермента, используют производные макропористых кремнеземов например аминосилохром который обрабатывают смесью конденсирующях агентов и лягандов в сооТaezczsymziax буферных системах. Например, для очистки карбоксильных протеиназ — смесью, содержащей бензохянон и антибиотики-полипептиды, для сериновых протеиназ — смесью, содержащей янтарный ангидрид, и-(й—

-аминометил)фенялборную кислоту и водорастворимый карбодяямид.

Сорбцию ферментов проводят в динамическом или статическом режиме. При этом происходит избирательное связывание протеиназ с нерастворимым носителем. Затем носитель со связанным белком промывают соответствующим буферным рас". âîðîì. .При этбм происходит отделение примесей, в том числе и окрашенных. способствующие более эффективной десорбции.

Очищенный фермент используют в виде раствора или высушивают лиофяльно после обессоливания гельфильтрацией или диализа.

В приведенных примерах по очистке ряда протеиназ на колонке с биоспецифическими сорбентами количество нанесенного и элюированного белка измерено в мг, а также в условных оптических единицах, т.е. в единицах оптической плотности при 280 нм.

Активность ферментов измерена по скорости гидролиза гемоглобина (пример 1, 2); по,скорости створаживания молока (примеры 3 — 6), по скорости расщепления синтетических субстраToB: g -карбоксипропионилфенилаланина (пример 7) и п-нитроанилида карбобензокси-L-аланил-L-аланял-;лейцина (пример 8).

Пример 1. Очистка промышленного препарата пепсина свиньи на бацитрацин-силохроме.

Для синтеза бацитрацин-силохрома используют 1 г аминосилохрома (340 мкмоль аминогрупп на 1 r) в

О,, М NaiiCO, рН 10,0, 34 мг п-бензохинона в 2 мл абсолютного диметилформамида и 220 мг бацитрацина.

Смесь осторожно перемешивают 4 ч и оставляют на ночь при 5 C. Затем сорбент тщательно промывают 0,1 М

YaliCO- с рН 10, водой, спиртом, а

> перед опытом всеми элюирующими растворами. Полученный темноокрашенный сорбент по данным аминокислотного анализа содержит 46 мкмоль бацитрацина на 1 r сухого сорбента. Для очистки пенсина 0,1 N ацетатный буферный раствор с рН 5,0, содержащий неочищенную протеиназу с удельной активностью 23 е,а./о.е., пропускают через хроматографическую колонку

,5x0,5 см), заполненную бацитрацинсялохромом. Затем сорбент промывают исходным буфером. Активный фермент элюируют 25Ъ-ным изопропиловым спиртом в 1 М NaCp с рН 5,0. Удельная активность пепсина свиньи в элюате

34 е.а./мг. Выход по активности 100%, очистка в 1,5 раза.

Пример 2. Очистка промышленного препарата пепсина свиньи на бациллихин- силохроме.

Промышленный препарат бациллихина содержит нерастворимый наполнитель. Для извлечения бациллихина препарат трижды экстрагируют кипящим метанолом иля этанолом. Экстракты упаривают в вакууме до небольшого объема. Осадок бациллихина, выпавший при охлаждении, отфильтровывают и высушивают.

Для синтеза бацяллихин-силохрома используют 100 г аминосилохрома

942427 (120 мкмоль аминогрупп на 1 г) в

0,1М ИаНС03, рН 10, 864 мг и"бензохинона в 50 мл абсолютного диметил.формамида и 12,8 г бациллихина.

Смесь осторожно перемешивают 4 ч и оставляют на ночь при 5 С. Затем сорбент тщательно промывают 0,1М

NaHCO рН 10, водой, спиртом, а перед опытом всеми элюирующими растворами. Полученный темноокрашенный сербент по данным аминокислотного анализа содержит 1b мкмоль бациллихина на 1 г сухого сорбента. 1(ля очистки пепсина 0,1М ацетатный буферной раствор м рН 5,0, содержащий неочищенную протеиназу с удельной активностью 22 е.а./о.е., пропускают через хроматографическую колонку (5x0,5 см), заполненную бациллихинсилохромом. Затем сорбент промывают исходным буфером. Активный фермент элюируют 2ЬЪ-ным изопропиловым спиртом в 1М NaCg pH 5,0. Удельная активность пепсина свиньи в элюате

34 е.а./мг. Выход по активности составляет 100Ъ, очистка в 1,5 раза.

Пример 3. Очистка протеиназы из Trichoderma I!ignorum на бацитрацин-силохроме.

Синтез бацитрацин-силохрома осуществляют по примеру 1. 0,1М ацетатный буферный раствор с рН 5,0, содержащий 4 г. белка (неочищенную смесь протеиназ и целлюлаз) с удельной активностью 13,0 е.а./o.е,, пропускают через хроматаграфическую колонку (бх1,5 см), заполненную бацитрацин-силохромом. Затем сорбент промывают исходным буфером и элюируют послЕдовательно 1М NaCE в том же буфере и 25Ъ-ным изопропанолом в 1M NaC(I, рН 5,0. Собирают солевую (1) и изопропанольную (11) фракции элюата, содержащие активный белок.

Удельная активность фракции 1

216 е.а./о.е. Очистка в 16,6 раза.

Удельная активность фракции 11

58,6 е.а./о.е. Очистка в 4,4 раза.

Выход активного белка 97Ъ.

Пример 4. Очистка ультрафильтрата культуральнай жидкости базидального гриба RussuIa decdorans

Fr †04 на бацитрацин-силахроме.

Синтез бацитрацин-силохрома осуществляют по примеру 1. Ультрафильтрат культуральной жидкости с удельной активностью 13 е.а./о,е. по створаживанию молока пропускают через хроматаграфическую колонку (6x1,5 см), заполненную бацитрацинсилохромом и уравновешенную 0,1М ацетатным буфером, рН 4,5. Затем сорбент промывают исходным буфером и последовательно элюируют 1M NaCI, рН 4,5 в том же буфере (фракция 1) и 25Ъ-ным изопропанолом в 1M NaCI рН 5,0 (фракция 11) . Удельная активность фракции 1 - 664 е.а./о.e., очистка в 51 раз, Фракции 11

260 е.а./о.е., очистка в 20 раз.

Выход. активного белка 100Ъ.

Пример 5. Очистка ультрафильтрата культуральной жидкости базидального гриба Вцззп?а бесйогапз

Fr-0456 на бациллихин-силахроме.

Синтез бациллихин-силохроме. осуществляют по примеру 2. Ультрафильтрат культуральной жидкости, с удельной активностью 3,3 е,а./о.е. пропускают через хроматографическую колонку (5x0,5 см), заполненную бациллихин-силохромом, уравновешенную

0,1М ацетатным буфером, рН 4,5. За15 тем промывают сорбент тем же буфером. Активный фермент элюируют 20Ъ изапропанолом в 1М NaCI рН 4 5.

Удельная активность фермента B элюате 120 е.а./о.е., очистка в 36 раз.

20 ВыхОд ПО активности 90ъ.

Пример б. Выделение двух протеиназ из высушенного экстракта культуральной жидкости базидальнаго гриба RussuIa decdorans Fr-0456 с помощью бациллихин-силохрома и грамицидин-С-силохрома.

Экстракт, содержащий фсрмент с удельной активностью 180 е.а./о.е., пропускают через хроматографическую колонку (25х1,5 см) с бациллихинсилохромом, уравновешенную 0,1М ацетатным буфером, рН 4,5, Собирают прошедший через сорбент раствор,который содержит протеиназу 1. Удельная активность раствора 2,6 е.а./о.е.

Колонку промывают исходным буфером.

Протеиназу 11, сорбированную на колонкер элюируют 20 - -ным изопропанолом в 1M NaCI, рН 4,5. Удельная активность фермента " элюате 380 е.а./о.е.

40 Выход по активноеTH 88Ъ, Очистка в

2, 4 раза.

Раствор, содержащий протеиназу 1, Не сорбировавшуюся на бациллихинсилохроме, пропускают через хроматографическую колонку (18=1 см} с грамицидин-С-силохромом.

Для получения сорбента используют

50 г аминосилохрома (50 мкмоль аминогрупп на 1 г} в 0,1M NaHCOg, рН 10, 162 мг и-бензохинона в 30 мл абсолютнага диметилформамида и 2,.1 r грамицидина С,,условия синтеза те же, что в примерах 1,2.

Колонку с сарбираванной протеиназой 1 промывают 0,1М ацетатным бу фером, рН 4,5, активный фермент элюируют 20Ъ-ным изопропанолам в

1 М NàC(!, рН 4,5. Удельная активность фермента в злюате 370 e,a./o.e., --очистка в 3,7 раза, выход )Io активности 60Ъ.

П р и м e p 7. Очистками -химатрипсина на фенилборонат-силохроме.

Для синтеза сорбента испольэовали аминосилохром (415 мкмоль амино942427

10 групп на 1 г), янтарный ангидрид и хлоргидрат п-(Q-аминометил)фенилборной кислоты.

3 r аминосилохрома обрабатывают в течение 20 мин при 20 С раство0 ром 1 r янтарного ангидрида в 9 мл диметилформамида. Избыток ангидрида удаляют промывкой 50 мл диметилформамида и водой. К 3 r полученного сукцинилсилохрома прибавляют 333 мг хлоргидрата п-(Ы-аминометил)фенил- 10 борной кислоты в 15 мл воды. Затем . при рН 5 добавляют 3 г водорастворимого карбодиимида. Смесь выдерживают 1 ч при 20 С при осторожном периодическом перемешивании. Сорбент отфильтровывают и промывают большим количеством воды, а перед опытом всеми элюирующими растворами. Полученный фенилборонат-.силохром содержит 215 мкмолей лиганда на 1 г сухого сорбента (или 100 мкмолей на

1 мл влажного сорбента} . На колонку с 2 мл фенилборонат-силохрома наносят раствор 10 мг (6 -химотрипсина в 10 мл 0,05 M фосфатного буфера, рН 7,5. Удельная активность раствора

0,025 е.а,/мг. Затем сорбент промывают 50 мл исходного буфера, 1М NaCI в том же буфере, 0,5 М глицерином в том же буфере, Фосфатным буфером, рН 9, и элюируют белок 0,5 М пентаэритритом в 0,05 М фосфатном буфере, рН 9. Получают 5,9 мг белка с удельной активностью 0,053 е.а./мг. Выход по активности 100Ъ, очистка в

1,7 раза. 35

П. р и м е р 8. Очистка субтилизина А-50 на фенилборонат-силохроме.

На колонку с 4 мл фенилборонатсилохрома, полученного по методу, 4() приведенному в примере 7, и уравновешенного 0,05 М фосфатным буфером, рН 7,5, наносят 40 мл культуральной жидкости Bac SubtiIis А-50 с рН 7,5, с удельной активностью 0,08 е,а./мг по гидролизу Š— AIa-AIa-Leu — рКА. Колонку последовательно промывают

0,05 М фосфатным буфером, рН 7,5, 1N NaCI в том же буфере, 0,5М глицерином в том же буфере, 0,05М фосФатиым буфером, рН 9. Активный белок элюируют 0,5М пентаэритритом в

0,05М Фосфатном буфере, рН 9. После обессоливания и лиофилизации получают 2,26 мг белка с удельной активностью 1,08 е.а./мг, выход 80%, 55 очистка в 13,7 раз.

Пример 9. Синтез Фенилборо- . нат-силохрома с применением в качестве конденсирующего агента гекса)метилендиизоцианата, 60

К 1 г аминосилохрома (340 мкмоль

NHg-групп) приливают избыток гексаметилендиизоцианата и оставляют при комнатной температуре на 15 мин, затем промывают аминосилохромдиметилФормамидом и водой. Получают сорбент, содержащий 300 мкмоль изоцианатных групп на 1 г носителя. К 1 r такого сорбента приливают раствор 200 мг и-(GJ аминометил)фенилборной кислоты н 5 мл диметилформамида, оставляют на 20 мин при комнатной температуре, затем избыток реактивов отмывают диметилфррмамидом и водой. Получают

Фенилборонат-силохром с содержанием лиганда 150 мкмоль/г.

Пример. 10. Очистка пепсина на грамицидин-С-силохроме.

К раствору 25 мг препарата свиного пепсина (производства Московского мясокомбината) в 10 мл 0,05М универсального буфера, рН 1,8, добавляют

200 мг грамицидин-С-силохрома, перемешивают 20 мин, раствор декантируют, промывают сорбент пять раз по 5 мл универсального буфера, рН 1,8, и элюируют пепсин дважды по 5 мл 1М хлористого натрия в 0,05М универсальном буфере, рН 1,8, содержащем 25% изопропанола. Выход по активности ЗОВ, очистка в 10 раз.

Пример 11. Очистка-субтилиI зина ВРИ на бацитрацин-силохроме.

К раствору 25 мг субтилизина BPN (Серва ) в 10 мл универсального буфера, рН 6,0, прибавляют 200 мг бацитра 7ин-силохрома, перемешивают

20 мин, промывают сорбент пять раз по 5 мл 0,05М универсального буфера, рН 6,0, и элюируют субтилизин дважды по 5 мл 1N хлористого натрия в

0,05М универсальном буфере, рН 6,0, содержащем 25Ъ изопропанола. С выхо-! дом 45% получают субтилизин BPN, обладающий активностью по Е-AIa AIa-Leu — pNA, 1,5 е.а./мг, очистка в

1,5 раза.

Пример 12. Очистка субтилизина 72 на бацитрацин-силохроме.

На колонку с 10 мл бацитрацин-силохрома, уравновешенную 50 M трис-буфером, рН 8,5, наносят раствор 2 г промышленного препарата субтилизина

72 (Протосубтилин ГЗх) с удельной активностью 0,166 е.а./мг. Колонку промывают 50 мМ трис-буфером, рН 8,5, затем 1N хлористым натрием в том же буфере. Активный фермент элюируют

1N хлористым натрием в 50 мМ трисбуфере, рН 8,5, содержащем 20% изопропанола. В результате получают

56 мг препарата с удельной активностью 7,7 е.а./мг. Выход по активности 130%, очистка в 40 раз.

Пример 13. Очистка щелочной сериновой протеазы Вас. Licheniformis на фенилборонат-силохроме °

На колонку с 4 мл фенилборонатсилохрома (200 мкмоль лиганда на 1 г. сорбента), уравновешенную 0,5N глицерином в 0,05М фосфатном буфере, 942427

Составитель

Редактор О. Филиппова Техред А,вабинец КорректорА. Зимокосов

Эаказ 1009/1 Тираж 522 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП Патент, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 рН 6,0, наносят раствор 10 мг промышленного препарата сериновой протеазы Вас. ?1cheniformis в 5 мл того же буфера. Колонку промывают тем же буфером, 1М хлористым натрием в

0,05М фосфатном буфере, рН 6,0, и

0,05М фосфатным буфером, рН 9,5.

Протеазу элюируют 0,5N пентаэритритом в 0,05М фосфатном буфере, рН 9.5.

Выход по активности 150%, очистка в 5,6 раз, полученный препарат имеет удельную активность. определяемую по

5 гидролизу Е-AIa-AIa-Üå÷-pNA, 18 е.а./мг.