Способ определения холиномиметических и холиноблокирующих свойств фармакологических средств холинергической природы

Способ определения холиномиметических и холиноблокирующих свойств фармакологических средств холинергической природы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

Союз Советских

Социалистнческих

Реслублнк (61) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 11. 03. 80 (21) 2925646/28-13 (51) М. КП. с присоединением заявки ¹â€”

6 01 М 33/48

Государственный комитет

СССР по делам изобретений и открытий (23) Приоритет

Опубликовано 300782 Бюллетень № 28 153) УДК 612.13 (088.8) Дата опубликования описания 300782

{72) Авторы изобретения

ВСЕСОЮЗН.й 1

11ЛтЯНГИО.

ТЕХВИЧЗККАФ

&ИБЛИО П;ь л

A.H.Kóáàðêo и В.Н.Гурин

Минский ордена Трудового Красного Знамени государственный медицичский институт (71) Заявитель (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ХОЛИНОМИМЕТИЧЕСКИХ

И ХОЛИНОБЛОКИРУЮРДХ СВОЙСТВ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКИХ

СРЕДСТВ ХОЛИНЕРГИЧЕСКОЙ ПРИРОЯИ

1 2

Изобретение относится к медицине и может быть использовано при скрининте вновь синтезируемых и не исследованных на биологическую активность органических веществ для выявления их холиномиметических и блокирующих свойств.

Известен способ определения холиномиметических и холиноблокирующих свойств фармакологических средств холинергической тлиоод-1 путем исследования свойств испытуемых веществ на экспериментальных животных f1).

Однако известный способ требует длительного наблюдения и регистрации эффектов вводимых животным фармакологических веществ, болыаого числа экспериментальных животных.

Цель изобретения — ускорение способа, обеспечение скрининга новых органических препаратов и экономия лабораторных животных.

Поставленная цель достигается тем, что водный раствор испытуемого вещества добавляют к фосфолипиду, измеряют температуру фазового перехода смеси и по направлению смещения температуры фазового перехода определяют миметические или блокирующие свойства вещества.

Способ осуществляется следующим образом.

Фосфолипиды, необходимые для исследования, выделяют из общего липидного экстрата головного мозга крыс.

Общий липидный экстрат вносится в раствор хлороформа в колонку размерами 2х50 см, заполненную силнкагелеM

40/500 меш на 1/3 ее объема. Злюирование осуществляется смесью хлороформ: метанол:вода в соотнощении

65:25:4 по объему. Скорость элюирования 2-3 мм в 1 мин, объем элюатов в каждой пробе 3 мл. Выход фракций фосфолипидов и их чистота контролируются хроматографически в тонком слое в системе растворителей, идентичной по составу элюирующей смеси. Фракционированные фосфолипиды упариваются в токе азота и перекристаллизовываются из смеси хлороформ:ацетон 1:10 при

15-20 С. Осадок кристаллов белого цвета после центрифугирования высущивается в .вакууме при комнатной температуре в течение 2-3 ч. В случае необходимости вещества хранятся в ацетоне при 15-20 С.

Выделение предлагаемым способом вещества, при исследовании их ФазоЗО вых переходов в смеси фосфолипид

947767 трис-буфер,(pH 7,4), в соотношении

1 мг:1 мкл способом дифференциальносканирующей.калориметрии на калориметре DSC-2 (Perkln-Elmer) показывают следующие температуры фазового пе-. рехода гель-жидкий кристалл (табл.1). 5

Таблица 1.

Температуры фазовых переходов контрольных препаратов в трис-буфере 1:1, рН 7,4 !

Нагрев Охлаждение

50/мин, 5 /мин, С

ОС

Вещество

Фосфатидил этаноламин

Ь

Фосфатидилхолин

53,0

47,0

35,5

29,5

37,0

Приведенные в табл. 1 температуры фазовых пере Ждов могут иметь незна- 25 чительные отличия в различных группах животных, в силу чего в каждой новой партии фосфолипидов должны производиться свои контрольные записи.

Исследуемое Фармакологическое вещество.в виде раствора в трисбуфере

Т а б л и ц а 2

Т С фазового дТ С относительпррехода фос- но контроля фатидилхолина

М + m

Вероятность ошибки, {Р) Исследуемое вещество

Tpис-буфер рН 7,4 (контроль) .35,510, 01

Холиномиметики

+3,7i 0,49

n = 5

39, 2+0,49

38,9+О, 31

38,5+О, 17

36, 7+О, 21

37,6-0,27

Il Ацетилхолин

Карбохолин

+3,4+ 0,33

+2,7+0,46

+3,0+ 0,17

+1,2+0,21

+2,1-.0,27

Оксотреморин

Ареколин

Пилокарпин р .w 0,001

I-Я.

Холиноблокаторы

-2,4+0,25

33,1+0,25

33,1+0,07

I I I Атропин

n = 9

-2,4+0,07

Метамизил

-5,2+1,11

-7,0 0, 15

-11, 4+О, 27

28,5+0,15

Арпенал

Педифен

24,1+0,27

Сфинтомиелин - 41,5 добавляется с помощью микрошприца к сухому порошку фосфолипида в соотношениях фосфолипид:буферный раствор 1:1.

Полученная смесь герметизируется в специальных алюминиевых капсулах.06щий объем смеси составляет 3-6 мкл.

Капсула помещается в измерительную ячейку калориметра и выдерживается в изотермическом режиме при температуре, превышающей температуру фазового перехода фосфолипида íà 1(f С, до тех пор пока не прекратится смещение базовой линии прибора. Прекращение смещения базовой линии свидетельствует об окончании перемешивания компонентов смеси. Смесь охлаждается и нагревается со скоростью о

5 /мин. IIpH чувствительности прибора

0.5-1 мкал/с, при этом регистрируется температура Фазового перехода смеси.

В табл. 2 представлены данные по изменению температуры фазового перехода гель-жидкий кристалл фосфатидилхолина мозга крыс под влиянием ряда холиномиметиков в холиноблокаторов.. Исследуемые вещества растворяют в трис-буфере рН 7.4 и добавляют к

Фосфолипиду из. расчета фосфатидилхолин исследуемое вещество 1 моль:

1 моль. Контролем служит температура фазового перехода смеси фосфатидилхолин:трис-буфер рН 7,4 1:1.

947767

Продолжение табл. 2 лТ С относительно контроля

Исследуемое ве- Т С фазового щество перехода фосфатидилхолина

М + m

Вероятность ошибки, (P) -7,5+0,52

-2,8+0,3

-7,1+0,39

-1,2+0,14

-5,5+0,43

28,0+0,52

32,7+0,32

28,4+0,39

34,3+0,14

30,0+0,43

ИЭМ-506

Пахикарпин р < 0,001

l I l

Тропацин

Скополамин

Ганглерон

Формула изобретения

40

Составитель Н.Хрусталева

Редактор Н.Гришанова Техред А. Бабинец Корректор У. Пономаренко

Заказ 56 25/68 Тираж 887 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул. Проектная, 4

Для к ого из исследованных веществ ЬТ С вычислялась не менее чем из 4-х измерений, выполненных на различных образцах.

Из приведенных в таблице данных видно, что холиномиметики достоверно повышают температуру фазового перехода фосфатидилхолина, а в противоположность им холиноблокаторы понижают. Эта направленность изменений температуры фазового перехода под влиянием холиноблокаторов в холиномиметиков сохраняется и в других исследованных фосфолипидов:фосфатидилэтаноламина и сфинтомиелина.Таким образом, сопоставляя эффекты, различных фармакон*логических средств, можно in v.itro без применения животных предсказать характер из физиологических свойств..

Предлагаемый способ позволяет за короткое время провести скрининг большого-числа вновь синтезированных органических веществ и отобрать для дальнейших исследований те из них, которые проявляют активность in vitr6, позволяет сократить потребность в экспериментальных животных.

Способ определения холиномиметических и холиноблокирукщих свойств фармакологических средств холинергической природы путем исследования свойств испытуемых веществ, о т л и ч а ю шийся тем, что, с целью ускорения способа, водный раствор испытуемого вещества добавляют к фосфолипиду, измеряют температуру фазового перехода смеси и по направлению смещения температуры фазового перехода определяют миметические или блокирующие свойства вещества.

Источники информации, дринятые во внимание при экспертизе

1. Фармакопея СССР. Изд. 10-е, 1968, с. 3.