Способ получения иммобилизованных протеолитических ферментов

Патент 950770

Авторы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Союз Советских

Социалистических

Республик

950770 (61) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 16.12.80 (21) 3213901/28-13 (51)hA К@ з С 12 N 9/48

С 12 N 11/16 с присоединением заявокв." 3213902/28-13;

3213903/28-13; (23) ПриоритетвЂ” 3213904/28-13

Государственный комитет

С СС P по делам изобретений и открытий

Опубликовано 150882. Бюллетень N9 30 (S3) УДК 577.15. .07 (088. 8) Дата опубликования описания 150882 (72) Авторы изобретения

Ф.Б. Левин и Л.В. Сорокина (71) Заявитель

Московский ордена Трудового Кра медицин с кий стоматоло гиче с кий и ашко (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННЫХ

ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ

Изобретение относится .к медицине и технологии новых биологически активных соединений и может найти применение в производстве иммобилизованных ферментных препаратов для экспериментальных и лечебных целей.

Известен способ получения иммобилизованных протеолитических ферментов, в частности, химотрипсина, путем связывания с носителем-карбоксиметилцеллюлозой аэидным методом (1).

Однако полученные таким способом препараты не могут быть использованы в медицине и в биологических иследованиях, связанных с парентеральным введением их в организм, поскольку используемый носитель чужероден и небезвреден для организма.

Известен способ получения иммобилиэованных протеолитических ферментов с использованием в качестве носителя целых эритроцитов, предварительно активированных бифункциональным реагентом - глутаровым альдегидом H.3.

Однако получаемый препарат, хотя и является биосовместимым, характеризуется невысокой удельной активностью, обусловленной .малой емкостью химического связывания целых эритроцитов., Целью изобретения является повы5 шение активности получаемого продукта.

Указанная цель достигается тем, что при осуществлении способа получения иммобилизованных протеолитических ферментов путем связывания фермента с носителем, предварительно активированным глутаровым альдегидом, в качестве носителя используют мембраны эритроцитов.

В качестве протеолитических ферментов используют трипсин, химотрипсин, папани, фибринолизин.

Пример 1. Способ получения иммобилизованного трипсина . Эритроциты из 20 мп свежей крови кролика с добавлением 1/10 части по объему

3,8%-ного цитрата натрия получают центрифугированием при 1000 об/мин в течение 10 мин и промывают их 2 раза четырехкратными объемами раствора 0,15 М хлористого натрия. Осадок зритроцитов (8 мп ) гемолизируют 5 объемами холодной дистиллированной воды. Мембраны осаждают, промывают

5 раз пятикратными объемами холодной дистиллированной воды и отделяют

950770

Составитель О. Скородумова

Редактор О. Персиянцева Техред М.Надь Корректор С. Шекмар

Заказ 5899/29 Тираж 505

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Подписное

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4 центрифугированием при 3000 об/мин в течение 15 мин. К осадку мембран (3 мл ) добавляют 2,2 объема (6,6 мп

0,1%-ного раствора глутарового диальдегида на 0,1 М фосфатном буфере, рН 6,8 и инкубируют в течение. 1 ч при качании на шуттель-аппарате при комнатной температуре +20ОС. Затем суспензию отмывают центрифугированием при 3000 об/мин в течение 10 мин

4 раза десятикратными объемами холод- 10 ной дистиллированной воды. Полученный осадок (2,5 мл ) инкубируют с равным объемом раствора кристаллического трипсина на 0,1 М фосфатном буфере, рН 6,8, так, что конечная концен- 15 трация трипсина составляет 10 г/мл.

Инкубацию проводят в течение 6-12ч при качании на шуттель-аппарате при

+4 С. Полученный препарат иммобилизованного трипсина на тенях эри- 20 троцитов отмывают десятикратными объемами холодной дистиллированной воды 7 раз до полного отсутствия активности фермента в последней порции отмывающего раствора и осаждают цен- 25 трифугированием в течение 15 минут при 3000 об/мин. Таким образом получают препарат трипсина, иммобилизованного на мембранах эритроцитов.

Одновременно получают препарат трипси.30 на, иммобилизованного по прототипу на целых эритроцитах кролика.

В полученных препаратах определяют активность трипсина методом Ан- ° .бена и соотношения фермента и носителя. Активность в получаемом препарате 98-114 ° 10 ед/г. Препарат, полученный известным способом, обладает активностью 3553 ед/г.

Пример 2. Способ получения иммобилизованного химотрипсина. Мем- 40 браны эритроцитов получают и обрабатывают глутаровым альдегидом как описано в примере 1. Концентрация химотрипсина в смеси при инкубации с мембранами составляет 10 мг/мл. 45

Время инкубации 10-12 ч. -Полученный препарат обладает активностью 328800342000 ед/г. Препарат, полученный по способу-прототипу, обладает активностью 3051 ед/г.

Пример 3. Способ получения иммобилизованного фибринолизина.

Мембраны эритроцитов получают и обрабатывают как описано в примере

1. Концентрация фибринолизина в смеси при инкубации.с мебранами составляет 15 мг/мл. Длительность инкубации 10-12 ч. Получают препарат с активностью 53300-118518 ед/г, Препарат, полученный по способу-прототипу, обладает активностью 320,4 ед/г.

Пример 4. Способ получения иммобилизованного папаина. Мембраны эритроцитов получают и обрабатывают как описано в примере 1. Концентрация папаина в смеси при инкубации с мембранами составляет 10 мг/мл. Время инкубации 8-12 ч. Получают препарат с активностью 9530-11625 ед/г. Препарат, полученный по способу-прототипу, обладает активностью 874 ед/г.

Технико-экономическая эффективность изобретения заключается в значительном повышении активности получаемых продуктов.

Формула изобретения

1. Способ получения иммобилизо1

Ванных протеолитических ферментов путем связывания фермента с носителем, предварительно активированным глутаровым альдегидом, о т л и ч а юшийся тем, что, с целью повышения активности получаемого продукта, в качестве носителя используют мембраны эритроцитов.

2. Способ по п. 1, о т л и ч а ю шийся тем, что в качестве протеолитических ферментов используют трипсин, химотрипсин, папаин, фибринолизин.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1, Иммобилизованные ферменты.

Под ред. И.В. Березина, Т. 1, МГУ, 1976 .

2. Терешин И.М., Москвичев Б.В.

Иммобилизованные ферменты в медицине и медицинской проььыленности.вЂ”

В кн. Иммобилизованные ферменты.

Тезисы II Всесоюзного симпозиума получения и применения иммобилизованных ферментов. М., 1976.