Способ иммобилизации ферментов

Способ иммобилизации ферментов

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

<и>950771

Союз Советских

Социалистических

Республик (63) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 05.10.79 (23) 2849850/28- 13 с присоединением заявки №вЂ” (23) Приоритет—

Опубликовано 150882. Бюллетень ¹ 30

Дата опубликовайия описания 15.08.82 (53) М Кп з

С 12 N 11/14

Государственный комитет

СССР по делам изобретений и открытий (53) УДК 577.15. .07(088.8) (72) Авторы изобретения

Н. Б. Шйтова, Г. A. Коваленко, Л, В. Д. Соколовский и Э. А. Леви

Ордена Трудового Красного Знамени

Сибирского отделения AH (71) Заявитель (5 4) СПОСОБ ИММОБИЛИЗАЦИИ ФЕРМЕНТОВ

Изобретение относится к способам иммобилизации ферментов, получению гетерогенных катализаторов на неорганических матрицах.

Известен способ иммобилизации ферментов, в частности, щелочной фосфатазы, адсорбцией на карбохроме из нейтральных и щелочных буферных растворов $1). Используемый в качестве носителя карбохром представляет собой термическую сажу с нанесенным на ее поверхность пироуглеродом при пиролизе бензола (фракция с размером гранул 0,25-0,5 мм3.

Однако данный способ не обеспечи. вает высокой активности получаемых иммобилизованных ферментов, достигаемая активность не превышает 5-20% от исходной активности фермента в растворе. Кроме того, использование укаэанного носителя требует дополнительных затрат на его получение, при этом для данного носителя ограничены возможности регулирования макрокинетических свойств матрицы, прежде всего пористой структуры. Эта характеристика является черезвычайно важной для иммобилизации фермента, так как для получения стабильного и активного препарата размер пор носителя должен соответствовать размеру глобулы фермента и обеспечить транспорт субстрата и продукта реакции.

5 Целью изобретения является повышение активности иммобилизованных ферментов и упрощение процесса за счет применения более дешевых и доступных носителей.

Укаэанная цель достигается тем, что при осуществлении способа иммобилизации ферментов, адсорбцией на углеродсодержащих носителях в качестве носителей используют окись алюминия или окись кремния, или алюмосиликаты, эауглероженные при пиролизе углеводородов.

Минеральные матрицы, зауглероженные в различных каталитических реакциях пиролиэа углеводородов, фактически представляют собой отработанные катализаторы ряда нефтехимических производств. При этом используемые минеральные матрицы являются дешевыми и широко распространенными носителями с легко регулируемыми макрокинетическими характеристиками (пористая структура, площадь поверхности). Нанесенное на минеральный каркас углеродное покрытие обуславливает более прочное связывание

950771 фермента с носителем за счет связывания фермента с обеими составляющими носителя (как с минеральной матрицей, так и с углеродным покрытием).

Активность иммобилиэованных ферментов, полученных предлагаемым способом, составляет 20-50%.

Носители, используемые в предлага-, емом способе, получают следующим образом. кварцевый реактор (100 cM )

Пример 1. Иммобилиэация лак- татдегидрогенаэы на окиси алюминия,, зауглероженной при пиролизе дивинила.

Навеску АЗОВО (100 мг),, зауглероженного пиролизом дивинила согласно ,приведенной методике (% С = 16,5;

$зр, = 89 M2/r; размер частиц 0,25- 35

0,40 мм) заливают 3-5 мл воды и дезаэрируют до прекращения выделения пузырьков воздуха из пор адсорбента.

Эта предосторожность позволяет избежать денатурации фермента на границе 40 раздела жидкой и газообразной фаз, где ее скорость значительно выше, чем в растворе. Дезаэрированный носитель переносят в медленно вращающуюся колбу, .заливают 10 мл раствора 45 лактатдегидрогеназы (концентрация

0,4 мг/мл) в 0,05 М фосфатном буфере с рН = 6,0 и перемешивают в течение часа при 4 С. Слабо связанный о с носителем фермент удаляют трехкратным промыванием 1 М раствором хлористого натрия ° По разности количеств фермента в исходном растворе и в растворе после нанесения, соединенном с промывными водами, рассчитывают количество адсорбированной лактатдегидрогенаэы в миллиграммах

Фермента на грамм носителя, оно составляет 40 мг/г. Полученнйй препарат иммобилиэованной лактатдегидрогеназы заливают фосфатным буфером 60 .и выдерживают в течение недели. Как показывают измерения активности раствора и общий анализ на белок, десорбции фермента с поверхности носителя не .происходит. 65

Носитель с адсорбированным на нем ферментом загружают в беэградиентный реактор циркуляционной установки, термостатированной при 25 С, и определяют активность иммобилизованной лактатдегидрогеназы по уменьшению оптической плотности никотинамидадениндинуклеотида {NADH) при длине волны 340 нм в реакции, ката|лиэируемой этим ферментом

Н

СН ССОО+ БЛАН+ - — + СН СС00+ЩД+

II 1

0 0Н (nupg5am) (saxrnam) Скорость циркуляции выбирают такой чтобы скорость реакции от нее не зависела, что позволяет избежать протекания реакции во внутридиффузионной области.

Адсорбированная лактатдегидрогеназа сохраняет 35% активности от активности фермента в растворе. Адсорбция лактатдегидрогеназы на эауглероженном АЗ Оэ повышает ее термостабильность. При нагревании при 65 С в течение 10 ч сохраняется 45% начальной активности адсорбированной лактатдегидрогеназы, в то время как фермент в растворе при этой температуре полностью инактивируется за

1-2 мин.

Адсорбированный фермент значительно стабильнее при длительном хранении, чем фермент в растворе. Последний полностью деэактивируется в течение 1-2 недель в фосфатном буфере с рН = 6,0 при комнатной температуре.

Иммобилизованная же лактатдегидрогеназа сохраняет 90% активности от исходной величины в течение 6 мес при тех же условиях.

Пример 2. Иммобилиэация лактатдегидрогенаэы на окиси алюминий, эауглероженной при пиролизе бензола.

На АР,10, зауглероженный пироли зом бензола (% С = 3,4; S = 114 м г; размер частиц 0,25-0,40 мм), наносят

Фермент в количестве 30 мг/r по методике, описанной в примере 1.

Адсорбированный фермент сохраняет 30% активности от активности лактатдегидрогенаэы в растворе. Актив-. ность определяется также, как в примере 1. При хранении в течение 3 мес (Фосфатный буфер с рН 6,0 комнатная температура) -активность иммобилиэованного фермента сохраняется на 100% в сравнении с исходной.

Пример 3. Иммобилизация лактатдегидрогеназы на окиси кремния, эауглероженной при пиролизе толуола.

На S10, эауглероженный пиролизом толуола (% С 18,0 Я д = 66 м /r размер частиц 0,15-0,40 мм), наносят фермент по методике, отли950771

Формула изобретения

1. Жирков Ю. A. Чухрай Е. С., Полторак Q. М. и др. Адсорбционная иммобилизация щелочной фосфатаэы на карбохроме. Вест. Моск. ун-та.

Сер. "Химия", 1978, т. 19, 9 2, с. 127-132.

Составитель О. Скбродумова

Редактор О. Персиянцева Техред М.Надь Корректор С. Шекмар

Заказ 5899/29 Тираж 505

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Подписное

Филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул. Проектная, 4 чающейся от методики примера 1 тем, что адсорбцию проводят при комнатной температуре, периодически помешивая раствор фермента над носителем в течение суток. Остальные операции те же, что и в методике примера 1. Количество адсорбированной лактатдегидрогеназы составляет

25 мг/г.

Адсорбированная лактатдегидроге-. наза сохраняет 20% активности от ак- 10 тивности фермента в растворе (активность определяется так же, как в примере 1) . Адсорбция на эауглероженной окиси кремния повышает стабильность ,фермента при длительном хранении.Им- 15 мобилизованная лактатдегидрогенеэа сохраняет 100% активности в течение

3 мес при комнатной температуре и— рН = 6,0.

Пример 5. На А110Э, заугле- 20 роженный пиролизом дивинила (% С =

5 $ = 80 M2/г; размер частиц

0,4-0,6 мм) наносят щелочную фосфатаэу из кишечника цыплят ("Reanag") в количестве 10 мг/г по следующей методике: 50 мг носителя заливают 4 мп раствора фермента,, рН = 7,5, адсорбцию проводят при комнатной температуре в течение 4-5 ч при периодическом помешивании. КоличЕство адсорбированного фермента определяют по уменьшению его активности в растворе над носителем. Адсорбция фермента прочная и практически необратимая, что показано многократным испытанием в буферном растворе с рН = 7,5 в течение 2 недель.

Адсорбированная на зауглероженном

AIg0y щелочная фосфатаэа сохраняет

503 активности от активности фермента в растворе. Активность фермента определяется по скорости гидролиза п-нитрофенилфосфата, Накопление продукта реакции п-нитрофенола регистрируется спектрофотометрически при длине волны 400 нм. 45

Через 2 недели хранения в буфере с рН = 7,5 адсорбированная щелочная фосфатаза не потеряла своей первоначальной активности.

Пример 6: На зауглерожен". ную окись алюминия (Ъ С = 24, S =

17 м /г, размер частиц 0,25-0,40мм) наносят лактатдегидрогеназу по методике примера 3 в количестве 31 мг/г.

Адсорбция практически необратима: при выдерживании в буферном растворе с рН = 6,0 в течение 2 сут фермент над носителем не обнаруживается.

Адсорбированная на эауглероженной окиси алюминия лактатдегидрогенаэа сохраняет 40% активности от активности фермента в растворе.

3а неделю хранения в буферном растворе с рН = 6,0 адсорбированный фермент сохраняет .80% первоначальной активности.

Технико-экономическая эффектив ность предлагаемого способа заключается в значительном упрощении процесса, достигаемом за счет использования в качестве носителей отработан-. ных катализаторов ряда нефтехимических производств, в частности крекинга углеводородов, а также в повышении активности получаемых иммобилиэованных ферментов.

Способ иммобилизации ферментов адсорбцией на углеродсодержащих носителях, отличающийся тем, что, с целью упрощения процесса и увеличения активности иммобили зованных ферментов, в качестве носителей используют окись алкминия, или окись кремния, или алюмосиликаты, эауглероженные при пиролиэе углеводородов.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе