Способ получения антигена для диагностики salmonella typhimurium - инфекции птиц
Патент 955573
Авторы
Классы МПК
Способ получения антигена для диагностики salmonella typhimurium - инфекции птиц
Реферат
1. Способ получения антигена для диагностики Salmonella typhimurium -инфекции птиц, включающий получение бактериальной массы S.typhimurium, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности и специфичности антигена, из бактериальной массы выделяют О-антигенную фракцию и сенсибилизируют ею формалинизированные эритроциты барана.
2. Способ по п.1 , отличающиеся тем, что О-антигенную фракцию выделяют водной экстракцией бактериальной массы при 95 - 100oС в течение 2,0 - 2,5 ч с последующим фракционированием ее 6,0 - 6,5 объемами этанола. Изобретение относится к области ветеринарной микробиологии, в частности к способам получения диагностических препаратов, используемых для массовой прижизненной диагностики сальмонеллеза птиц. Известен способ получения диагностических препаратов, включающий выделение антигенной фракции из микробных клеток в виде полисахаридно-полипептидного комплекса с последующей сенсибилизацией ею формалинизированных эритроцитов [1] Недостатком известного способа является то, что антигены, полученные из бактериальной массы Salmonella typhimurium, серологически мало или совсем не активны в реакции непрямой гемагглютинации, которая, в частности, необходима для ранней и точной прижизненной экспресс-диагностики сальмонеллеза. Это обусловлено тем, что при гидролизе выделяется антигенный комплекс, в котором количество высокомолекулярных белковой природы Н-антигенов значительно больше, чем O-антигенов полисахаридно-полипептидной фракции S. typhimurium. Антигены белковой природы обладают низкими сенсибилизирующими свойствами, так как они не вступают в прочную химическую связь с рецепторами эритроцитов. Кроме того, что Н-антигены сами по себе не могут служить сенситипом, присутствие их снижает, а при большом содержании практически полностью блокирует процесс сенсибилизации эритроцитов полисахаридно-полипептидной фракцией (O-антигеном). Известен также способ серологической диагностики S.typhimurium инфекции птиц, при котором в настоящее время применяется цветной корпускулярный антиген в капельной и пробирочной реакции агглютинации. Способ получения цветного антигена заключается в выращивании S.typhimurium на питательной среде, получении бактериальной массы центрифугированием, обеспложивании микробных клеток формальдегидом с последующей окраской анилиновыми красками [2] При осуществлении такого способа невозможно получить высокочувствительный и специфичный антиген. Многократные исследования цветным антигеном даже через месяц после экспериментального заражения птиц S.typhimurium не обеспечивают выявления всех птиц-бактерионосителей. Особенно низка диагностическая эффективность этого антигена при исследовании уток и гусей. Кроме того, при исследовании этим антигеном нередки случаи неспецифических реакций у птиц, свободных от S. typhimurium, так как бактериальные клетки, имеющие Н-антигены, после окраски анилиновыми красками в процессе хранения приобретают свойства к спонтанной агглютинации. В связи с этим и срок хранения цветного антигена крайне ограничен (до 3 месяцев). Повысить чувствительность цветного антигена S.typhimurium практически невозможно. Это обусловлено особенностью гуморального иммунологического ответа организма птиц при S.typhimurium-инфекции, характеризующегося более высоким уровнем гемагглютинирующих и неполных антител и низким титром агглютининов в крови птиц-бактерионосителей, ответственных за феномен макроскопической агглютинации цельноклеточного антигена. Вследствие крайне низкой эффективности цветной антиген в птицеводстве нашей страны не применяется для массовой прижизненной диагностики S.typhimurium-инфекции. Однако в условиях промышленного птицеводства, когда на ограниченных площадях концентрируются десятки миллионов птиц, без наличия высококачественного диагностикума не представляется возможным ликвидировать заболевание и обеспечить стабильное благополучие хозяйств по данной инфекции. Целью изобретения является повышение чувствительности и специфичности антигена, пригодного для выявления всех видов птиц-носителей S.typhimurium в полевых условиях. Поставленная цель достигается тем, что из бактериальной массы выделяют O-антигенную фракцию и сенсибилизируют ею формалинизированные эритроциты барана. O-антигенную фракцию выделяют водной экстракцией бактериальной массы при 95 100oC в течение 2 2,5 ч с последующим фракционированием ее 6 - 6,5 объемами этанола. При таком способе из бактериальной массы S.typhimurium получают наиболее активный и специфичный антиген растворимую O-антигенную фракцию, которая обладает высокой гемосенситивной, агглютинационной и антителосвязывающей активностью, значительно превосходящей по диагностической ценности цельноклеточный цветной антиген S.typhimurium. Метод водной экстракции в отличие от гидролиза (например, уксусной или трихлоруксусной кислотой) позволяет получить O-антигенный комплекс с небольшим содержанием белковых компонентов Н-антигенов, обладающий высокими сенсибилизирующими и антителосвязывающими свойствами, а высокая температура при экстракции, не оказывая отрицательного влияния на термостабильную O-антигенную фракцию, инактивирует термолабильные Н-антигены, значительная часть (альбуминная фракция) которых удаляется фракционированием в спирте-ректификате. Пример получения 100 тыс. доз антигена. А. Получение O-антигенной фракции S.typhimurium. Бактериальную массу S. typhimurium, выращенную на обычных питательных средах, осаждают центрифугированием при 5000 об/мин в течение 25 мин, отмывают от компонентов среды физиологическим раствором при том же режиме центрифугирования. Осадок отмытой бактериальной массы суспендируют в дистиллированной воде до концентрации 90 млрд. микробных клеток в 1 мл по оптическому стандарту мутности и экстрагируют при 95 100oC в течение 2 ч. Экстракт освобождают от бактериальных клеток центрифугированием при 5000 об./мин в течение 30 мин. O-антигенную фракцию из экстракта осаждают шестью объемами спирта-ректификата, отделяют центрифугированием при 4000 об./мин в течение 20 мин и растворяют в дистиллированной воде (рН 7,6 8,0) из расчета 6 г сухого вещества на 1 л воды. Б. Формалинизация эритроцитного барана. 2 л крови барана в равном объеме раствора Олсевера центрифугируют при 2000 об. /мин в течение 10 мин, осадок эритроцитов трижды отмывают фосфатно-буферным раствором (рН 7,2 7,4) при том же режиме центрифугирования и суспендируют в буферном растворе, содержащем 0,3% формальдегида. Взвесь эритроцитов выдерживают при 40oC в течение 14 18 ч при постоянном помешивании на магнитной мешалке при 90 об./мин. Формалинизированные эритроциты осаждают центрифугированием при 2000 об./мин в течение 10 мин и 3 раза отмывают пятью объемами буферного раствора. В. Сенсибилизация формалинизированных эритроцитов барана O-антигенной фракцией S.typhimurium. На 1 л 10%-ной взвеси формалинизированных эритроцитов на фосфатно-буферном растворе (рН 7,2 7,4) добавляют 250 300 мл 0,6%-ного водного раствора O-антигенной фракции S. typhimuium, тщательно перемешивают и подогревают в водяной бане при 56 60oC в течение 45 мин, а затем выдерживают в термостате при 40oC в течение 4 ч. Эритроциты освобождают от раствора сенситина центрифугированием при 2000 об./мин в течение 10 мин. Осадок эритроцитов трехкратно отмывают пятью объемами буферного раствора при том же режиме центрифугирования. Осадок сенсибилизированных и отмытых эритроцитов суспендируют в фосфатно-буферном растворе до 10%-ной концентрации, добавляют формальдегид из расчета 0,03 0,035% Антиген для прижизненной диагностики S.typhimurium-инфекции птиц, полученный предлагаемым способом, значительно эффективнее цельноклеточного цветного антигена, сохраняет активность и специфичность в течение 9 месяцев при 2 6oC. Результаты опытов (табл. 1- 6) свидетельствуют о том, что антиген S. typhimurium, полученный предлагаемым способом, по чувствительности превосходит известный цельноклеточный цветной антиген в пробирочной реакции в 6 10 раз, а в производственных условиях выявляет в 3 5 раз больше птиц-носителей S. typhimurium и не вступает в реакцию с гетерологическими антителами. Следует особо подчеркнуть низкую диагностическую ценность цветного антигена в кровекапельной реакции через 60 90 дней после заражения птиц. В условиях промышленного птицеводства для массовой прижизненной диагностики этой инфекции может быть применена только кровекапельная реакция. Основные преимущества полученного предлагаемым способом антигена заключаются в высокой чувствительности, специфичности, стабильности и пригодности для исследования в полевых условиях всех видов домашних птиц (кур, индеек, гусей, уток) в любом возрасте, что исключительно ценно в условиях современного интенсивного промышленного птицеводства. Указанные преимущества антигена, полученного новым способом, обусловлены высокой сенсибилизирующей активностью и способностью O-антигенной фракции, адсорбированной на эритроцитах, вступать в макроскопически видимую реакцию на стекле не только при наличии агглютининов, как это имеет место при цельноклеточном антигене, но и при наличии гемагглютинирующих и других видов циркулирующих антител, если даже их суммарный титр выражается в сотых и даже тысячных долях микрограмма в 1 мл крови птиц. Учитывая широкое распространение S.typhimurium-инфекции птиц и то, что в настоящее время птицеводство нашей страны не имеет на вооружении антигена для прижизненной диагностики этой инфекции, предлагаемый антиген представляет большой интерес для птицеводческой промышленности, в частности его применение позволит ликвидировать S. tyhimurium-инфекцию птиц, сократить сроки оздоровления хозяйств от заболевания в 3 4 раза, повысить сохранность молодняка птиц и тем самым ликвидировать один из главных источников сальмонеллезной токсикоинфекции людей. Методика исследования птиц не меняется по сравнению с используемой для известного антигена. ТТТ1 ТТТ2 ТТТ3 ТТТ4
Формула изобретения
1. Способ получения антигена для диагностики Salmonella typhimurium -инфекции птиц, включающий получение бактериальной массы S.typhimurium, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности и специфичности антигена, из бактериальной массы выделяют О-антигенную фракцию и сенсибилизируют ею формалинизированные эритроциты барана. 2. Способ по п.1 отличающийся тем, что О-антигенную фракцию выделяют водной экстракцией бактериальной массы при 95 100oС в течение 2,0 - 2,5 ч с последующим фракционированием ее 6,0 6,5 объемами этанола.РИСУНКИ
Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6