Штамм вifidовастеriuм lоnguм дк-100,n2168,используемый для изучения приживления экзогенных бифидобактерий в макроорганизме

Штамм вifidовастеriuм lоnguм дк-100,n2168,используемый для изучения приживления экзогенных бифидобактерий в макроорганизме

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Союз Советских

Социалистических

Республик

< >958494 (61) Дополнительное к авт. саид-ву (22) Заявлено 16.01. 81 (21) 3237028/28-13

f54}hi Ка з

С 12 N 1/00

//(С 12 N 1/00

С 12 R 1/01) с присоединением заявки № (23) Приоритет

Опубликовано 1.50982. Бюллетень. ¹ 34

Государственный комитет

СССР по делам изобретений и открытий (з3} УДК 576. 8. 093 (088. 8) \

Дата опубликования описания 15.09.82

t (72) Авторы изобретения

В.N. Коршунов, Б.В. Пинегин, Г.И. Гончарова и A.Ì.

2-й Московский ордена Ленина медицинский институт им. Н.И. научно-исследовательский инст и микробиологии им. Г.Н. (71) Заявители (54) ШТАММ BIFIDOBACTERIUN LONGGN ДК 100, 9 В-2168, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ

ПРИЖИВЛЕНИЯ ЭКЗОГЕННЫХ БИФИДОБАКТЕРИЙ

В МАКРООРГАНИЗМЕ

3 2 ч

Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано при изготовлении бактерийных лечебных препаратов, а также при изучении взаимодействия экэогенных бифидобактерий с микроорганизмом.

Известен штамм Bifidobacterium

longum (1).

Однако известный штамм не обладает действием, позволяющим быстро выделить его среди других бактерий, заселяющих кишечник после инокуляции в микроорганизм, и судить о приживлении экэогенных бактерий в различных отделах кишечника.

Целью изобретения является штамм, обладающий устойчивостью к высокой дозе антибиотика, позволяющей выделить данный штамм в чистой культуре из кишечника животных и людей, а также высокой антагонистической ак-. тивностью для приготовления лечебного препарата.

Для получения штамма использован исходный штамм ДВА-13 (Bifidobacterium longum), обладающий более высокой антагонистической активностью, выделенный из кишечника здорового человека. Из этого штамма после обработки его мутагеном был получен мутант, устойчивый к 100 мг/мл кана- мицина.

Предложенный штамм Bifidobacterium longum ДК-10, используемый арпа изучения прижнвления экэогенных бифидобактерий в макроорганиэме, хранится в коллекции ВНИИгенетика под номером В-2168.

Полученный штамм бифидобактерий

В. longum ДК-100 имеет следующие морфологическую и физиологическую характеристики.

Морфологические признаки. Клетки палочковидные, с У-образными раздвоениями на одном или обоих концах.

Неподвижны, в мазке располагаются беспорядочно. Грамположительны, иногда внутри клеток выявляется зернистость °

Культуральные признаки. В 0,7%-нОм агаре Блэурокка образуют колонии в виде пирамидок, гречичных зерен или дисков размером до 3-5 мм в диаметре»

В жидкой среде Блэурокка растут по всей пробивке, кроме зоны аэробиоэа, на 4-5 сут оседают на дно пробирки.

На плотной среде, а также и в жидкой растут в присутствии 100 мг/мл ка;намицина, в отличие от исходного штамма. Продолжительность лаг-фазы

958494

5-10 ч, время генерации 2, 00т0,75 ч, урожай клеток (5,91+1,22)х10 . После лиофильного высушивания -культуры продолжительность лаг-фазы и время генерации могут увеличиваться. Пигментов не образуют. 5

Физиологические признаки. Облигатный анаэроб, растет в высоком столбике агара или жидкой среды.

Максимум рбста при 37,5 С.

Биохимические свойства. Сбражива ет арабинозу, ксилозу, лактозу, ва-. риабельно-маннозу.

Чувствительность к антибиотикам (минимальные ингибирующие концентрации в мкг/мл или ЕД/мл) ° 15

Антибиотик ДК-100

Стрептомицин 200

Мономицин 200

Кан амицин 100 200

Гентамицин 40 20

Пеницилин 0,2-1,0

Ампициллин 0,5-1,0

Тетрациклин 2

Рифампицин 10

Хлорамфеникол 0,8

Лин комицин 0,1

Нистатин ) 100

Антагонистические свойства. При совместном культивировании в количест- венном соотношении 1:1 в жидкой среде Блэурокка подавляет рост 92,03Ъ

Eseherichia coli 0« (штамм III), 100,00Ъ Escherichia со 1 0 (штамм

122 ), 99,90Ъ S h i de11a flexneri (штамм 170) и 84,51Ъ Proteqs morgan (штамм 12), обладающих энтеропатогенными свойствами.

Штамм ДК-100 с приобретением устойчивости к 100 мг/мл канамицина сохранил антагонистические свойства.

Лабораторная проверка показала его 40 непатогенносты для:.экспериментальных животных (мышей, крыс, морских свинок), а также для людей (в опытах на добровольцах) .

Примеры практического использова- 45 ния.

Пример 1. Изучали влияние совместного применения антибиотикоустойчивых бифидобактерий и канамицина на выживаемость мышей при лучевой болезни.

Беспородных ьыаей весом 16-18 r облучают на установке ГУБЭ-1200 в дозе 700 р (мощность дозы - 140 р/мин).

После облучения животных разделяют на 4 равные группы по 20 мышей в каждой. Первая группа животных получала перорально канамицин и бифидобактерии ДК-100 с 1 по 21 день после облучения с интервалом в 48 ч. Вторая группа животных получала только антибиотики в те же сроки, что и м ши 1-ой группы, третьей группе животных вводили только бифидобактерии по аналогичной схеме, а четвертая группа животных получила физиологи- 65 ческий раствор хлористого натрия.

Суточная доза канамицина составляла

1 мг на мышь, бифидобактерии вводили в количестве 1 х 10 клеток на мышь.

lj

Антибиотик и бактерии вводили интрагастрально в объеме 0,25 мл. Опыт повторяли 4 раз а.

Резульаты опыта показали, что совместное применение устойчивых к

100 мг/мл канамицина бифидобактерий

В. longum ДК-100 и канамицина оказывает выраженное влияние на увеличение процента выживаемости облученных мышей. Это выявляется с 12-13 дня после облучения и в последующие сроки наблюдения разница в количестве выживших мышей в группах леченых и нелеченых животных постоянно увеличивается. На 13 день после облучения процент выживаемости в 1,2, 3 и 4 группах составлял 56,6; 50,0; 46,6 и 13,3 соответственно. На 30 день выживаемость составляла 33,3; 26,6;

20,0 и 3,3 процента соответственно.":Устойчивость бифидобактерий к антибиотикам позволяет начинать бактериотерапию одновременно с антибиотиками, способствуя предотвращению развития дисбактериоза у облученных мышей и увеличению за счет этого продолжительности их жизни.

Пример 2 ° Определяли приживляемость бифидобактерий, устойчивых к 100 мг/мл канамицина, в желудочнокишечном тракте крыс-гйотобионтов и распределение этих микроорганизмов на слизистой различных отделов кишечника.

В опыте используют 10 крыс-гнотобионтов в возрасте 6 недель. Животные получают бифидобактерии в течение

3 дней в дозе 1 х 10 клеток на крысу. Спустя 5,7, 15, 30 и 60 дней после окончания введения бифидобактерий делают высевы на 0,7Ъ-ный агар

Блэурокка от всех животных, а на

60 день животных забивают и из различных отделов кишечника выделяют от-. резки по 4-6 см в длину ° Выделенные участки кишечника разрезают в длину и тшательно промывают в физиологическом растворе хлористого натрия.

После этого отрезки кишечника взвешивают, гомогенизируют с соответствующим количеством физиологического раствора и из различных разведений гомогената делают высев на 0,7Ъ агар.

Соответственно каждому отделу кишечника делают аналогичные посевы содержимого его полости.

Применявшийся штамм хорошо прижился в кишечнике крыс и высевался в течение 2 мес наблюдения из испражнений в количестве 10 -10 клеток на

1 г материала. Через 2 мес количество бифидобактерий в полости и на слизистой различных отделов кишечника составило: тонкий кишечник — (1,0+

958494

Формула изобретения

Составитель С. Малютина

Редактор Н. Горват Техред А.Ач ° Корректор Н. Король

Тираж 505 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и.открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская иаб., д. 4/5

Заказ 6982/36

Филиал ППП Патент ., г Ужгород, ул. Проектная, 4

+2,3) х104 и (2,0+2,4) х10 бактерий йа 1 г материала соответственно1 слепая кишка — (2,0 0,8) х10 и (1,7+

+0,6)х10 соответственно; поперечноободочная кишка †(1,9 0,7)х10 и ,(2,0+1,8)х104 соответственно.

Воздействие детергентами и фермен, тами на отрезки толстого кишечника, выделенные из моноконтаминированных крыс, не приводило к уменьшению количества бифидобактерий на слизистой.

Пример 3. Определяли приживляемссть В. lonqum ДК-100 в желудочно-кишечном тракте конвенционных крыс и воэможность их выделения в чистой культуре иэ кишечника конвен- . 5 ционных животных на среде с канамицином.

Животных разделяют на 3 группы по

10 особей в каждой: первая группа жи. вотных получает бифидобактерии в до- Я эе lх10 клеток на крысу в течение

3 дней, вторая группа животных получает канамицин (50 мг/мг веса) одФ новременно с бифидобактериямк (lх10 клеток. на крысу), животные третьей g5 группы не пблучают бифидобактерий.

Череэ 5,7,15 дней гомогенаты слизистых и содержимого полости кишечника опытных и контрольных животных засевают на 0,7% агар Блэурокка с 30

80 мг/мл канамицина. Результаты опытов показали, что экзогенные антиби отикоустойчивые штаммы успешно колонизировали кишечник конвенционных крыс и были обнаружены практически во всех отделах кишечника, высеваясь в чистой культуре на среде с канамицином: 10 -10 в полости и на слизистой тощей кишки, 10 — на слизистой

1. и 10 -10" — в полости подвэдошной кишки, 10 -10. — на слизистой и 10

4 ч в полости. слепой кишки, 10 — на сли-. зистой и 10 -10 — в полости поперечноободочной кишки. Это ненамного меньше обычного популяционного Уровня. бифидобактерий у крыс и свидетельствует о хорошем приживлении экзогенных бифидобактерий в кишечнике. Необходимо отметить, что одновременное введение,канамиЦина не снижает приживляемости данного штамма бифидобактерий в кишечнике. У контрольных животных аналогичные бактерии не обнаружены.

Предложенный штамм обладает действием, позволяющим выделять его в чистой культуре среди других предсавителей микрофлоры желудочно-кишечного тракта.

Штамм может найти применение для изучения механизмов адгезии и взаимо. отношений бактерий желудочно-кишечного тракта, что позволит усовершенствовать бактериотерапию кишечных заболеваний человека и животных.

Штамм Bifldobacterium longum

ДК-100, М В-2168 (Коллекция ВНИИгенетика ), используемый для изучения приживления экзогенных бифидобактерий в макроорганизме.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Гончарова Г.И. с соавr. Культуральная, морфологическая и биохимическая характерйстика Bacterium bifidum. Труды МНИИЭМ. М., 1969, т.XIII, с. 415-426.