Способ определения активности гуанилатциклазы

Способ определения активности гуанилатциклазы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

Союз Советскив

Социалнстичесиих

Республик

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (6!) Дополнительное к авт. свид-ву(22) Заявлено 2О0281 (21) 3248740/28-13 (51) М. Кут.з

G 01 N 33/48 с присоединением заявки ЙоГосударственный комитет

СССР ио делам изобретений и открытий (23) Приоритет (53) УДК 547. 857 (088. 8) Опубликовано 150982. Бюллетень. Но 34

Дата опубликования описания 15Р982 (72) Авторы изобретен и и

A.Т. Пикулев, М.,В. Шолух и С.Н. Гилевич

"I

"L

I

Белорусский ордена Трудового Красного Зна государственный университет им, В.И. Лени (71) Заявитель (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ГУАНИЛАТЦИКЛАЗЫ

Изобретение относится к медицине, а именно энзимологии.

Известен способ определения активности гуайилатциклазы в биологическом материале путем добавления к исследуемой пробе гуаноэинтрнфосфата (ГТФ) с последующей инкубацией полученной смеси, выделения циклического 3,5-гуанозинмонофосфата (цГМФ) хроматографическим путем и последующего определением его концентрации фотометрически (1).

Однако известный способ сложен и имеет высокую токсичность, что ограничивает область его применения.

Целью изобретения является упрощение способа.

Эта цель достигается тем, что при осуществлении .определения активности гуанилатциклазы в биологическом материале путем добавления к исследуемой пробе гуанозинтрифосфата. (ГТФ) с последующей инкубацией полученной смеси, выделения цикличес.кого 3,5-гуанозинмонофосфата (цГМФ) 25 хроматографическим путем и определением его концентрации фотометрйчески, пробу после инкубации с ГТФ обрабатывают фосфатом кадмия, хроматографируют иа ионообменной); колои- 30 ке, заполненной полистирольнык анионитом, далее в пробу добавляют. сгир-: товый раствор нитрата тербия и по величине интенсивности флуоресцен- . цин при длине волны 545 нм определяют активность гуанилатциклазы.

Способ осуществляют следующим образом.

После инкубации ферментного пре» парата, гуанилатциклаэную реакцию останавливают. прогревом на кипящей водяной бане, пробы охлаждают и обрабатывают эквивалентньыи коли-, чествамн растворов хлорида (или сульфата) кадмия и .фосфата калия, осадок фосфата кадмия удаляют центри-фугированием. В этих условиях до

95% ГТФ соосаждается с фосфатом кад мия, в то время как 95-96% цГМФ остается в растворе. Для полного удаления следов ГТФ и других нециклических гуаниловых нуклеотидов (последние также усиливают нехарак теристическую флуоресценцию иона тербия) полученную.надосадочную жидкость. хроматографируют на колонке с полистирольиьвк анионитом .(типа

Дауэкс и т.п.), причем, цГМФ элюируют, 0,06 М нитратом аммония в 0,033 М ацетатиом буфере (рн 5,0), приготов»

958976

Формула изобретения

Ю. Алмазов карь

Составитель

Техред Л.Пе

КорректорА. Ференц

Редактор Л. Авраменко

Заказ 7008/61 Тираж 887 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж 35, Раушская наб., д 4/5

Филиал ППП Патент, r. Ужгород, ул. Проектная, 4..ленном на 86% этаноле. ГТФ в. этих условиях остается связанным с анионитом, К элюату, обработанному бевводньэю сульфатом натрия для связывания избытка воды,.добавляют раствор нит.рата тербия в этаноле, s присутствии 5 цГМФ характеристическая флуоресценция иона сербия значительно усиливается, что позволяет по калибровочной кривой определять.от О, 5 до 10 нмоль цГМФ в пробе и по .этйм данным рассчитать активность гуанилатциклазы. Оптимальные условия флуорйметрических измерений являются 96% (no объему) этанол, рН 5,0-5,6, нитрат тербия в конечной концейтрации 2 мм, возбуждение при 290 нм и регистрация флуоресценции при 545 нм.

Пример. Белые крысы стадного разведения умерщвлялись декапи-; тацией, головнай мозг быстро иЗВлекали и гомогенизировали в охлажденной среде выделения (20 мМ трио-HCP

-рН 7;6, 1 мМ ЭЖТА, 2 мМ дитиотреитол .в стеклянном гомогенизаторе с тефлоновым пестиком. Среда инкубацнн содержала (в конечных концентрациях)

20 мМ трис-НС2 рН 7,,6 10 мМ теофиллин, 4 мМ хлорид марганца, 1 мМ дитиотреитол, 1 мМ ГТФ, а также полученный гомогенат (концентрация белка 1 мг/мл) ..После 20-минутной инкубации проб при 37 С гуанилатциклазную реакцию останавливали прогревом на кипящей водяной бане. Охлажденные пробы обрабатывали эквивалентным количеством хлорида кадмия.и фосфа- 35 та калия и центрифугировали (3600 g, 45 мин). Надосадочные жидкости количественно переносили на колонки с анионитом.Дауэкс 2,8, уравновешенные

2, М нитратом аммония. Колонки промы- 4Q вали 70% этанолом, после чего цГМФ элюировали 0,06 M нитратом аммония в 0,033 М ацетатном буфере (рН 5,0), приготовленном на 86% этаноле; избыток воды удалялся безводным.сульфа- 45 том натрия. Ввиду ограниченной растворимости гуаниловых нуклеотидов в этаноле предварительно определялось максимальное количество цГМФ, полностью элюируемое с колонки при указанных условиях, оно оказалось равным 15 нмоль, что вполне достаточно для определения активности гуанилатциклазы в тканях млекопитаю. щих. К элюату, содержащему цГМФ,. добавляли раствор нитрата тербия

Ю в зтаноле (конечная концентрация

2 мМ) и измеряли интенсивность флуоресценции проб при 545 нм на спектрофлуориметре с длиной волны возбуждающего света 290 нм. Для приготовления контролей в эту же среду инкубации добавляли прокипяченный ферментный белок, а для получения калибровочных данных, кроме того, вносили известные количества цГМФ. Содержание белка в образцах определялось биуретовым методом с использованием бычьего сывороточного альбумина в качестве стандарта. Удельная активность гуанилатциклазы у животных разного веса, пола и возраста варьировала от 20 до 100 пмоль цГМФ/мин мг белка, что соответствует литературным данным. Наблюдаемые различия можно объяснить тем, что уровень цГМФ в большой степени подвержен гормональной регуляции.

Предлагаемый способ включает в себя простые методические операции, снижает токсичность, уменьшает потери продукта реакции и высокочувствительность.

Способ определения активности гуанилатциклазы в биологическом материале путем добавления к исследуемой пробе гуанозинтрифосфата (ГТФ) с последующей инкубацией по-. лученной смеси, выделения циклического 3,5-гуанозинмонофосфата (цГМФ) хроматографическим путем с определением его концентрации фотометрически, отличающийся тем, что, с целью i упрощения способа, пробу после ннкубации с ГТФ обрабатывают фосфатом кадмия, хроматографируют на ионообменной колонке, заполненной полистирольным анионитом, далее в пробу добавляют спиртовой раствор нитрата тербия и по величине интенсивности флуоресценции при длине волны 545 нм определяют активность гуанилатциклазы.

Источники информации, принятые so внимание при экспертизе

1. Wh1te A.A., Xarr D.В, Эшрхочей

two-step method for the assay of

adeny2ate and guany Pate cyc2ase .—

AnaXyt. B1ochem., 1978, 85, р. 451460.