Йодпроизводные дезокситионуклеотидов,как мономеры для синтеза олигодезокситионуклеотидов

Патент 960188

Авторы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

(72) Авторы изобретения

В.П. Кумарев и В.С. богачев (7!) Заявитель

Институт цитологии и генетики Сибирского (54) ЙОДПРОИЗВОДНЫЕ ДЕЗОКСИТИОНУКЛЕОТИДОВ КАК МОНОИЕРЫ

ДЛЯ СИНТЕЗА ОЛИГОДЕЗОКСИТИОНУКЛЕОТИДОВ

Изобретение относится к новым хи" мическим веществам, конкретно к йод-. производным дезокситионуклеотидов, которые могут быть использованы в качестве мономеров для синтеза олигодеэокситионуклеотидов.

Известны 5-йодпроизводные дезокситионуклеотидов, используемые в качестве мономеров для синтеза олигодезокситионуклеотидов общей формулы

1О э ов

О ОК

/ о se í,ñê где В - тимин, й4 - анизоилцитозин, и - бензоиладенин, М - иэобутирилгу анин;

К - катион лития или натрия. 20

Характерйой особенностью таких соединений, обусловливающей их примене" ние, является наличие в их структуре двух функциональных групп: 3 -8"/ "циан.

2 этилфосфотиоатной группы и 5 - атома йода. Замещение атома йода на остаток 2 -дезокси"И-ацилнуклеозид (или олиготионуклеотидил)"3 -фосфотиоата приводит к образованию олигодезокси" тионуклеотидов, содержащих на 3 -конце

5- -цианэ1илфосфотиоатную группу. После щелочного гидролиза(Ъ"цианэтильной защиты фосфотиоатная группа освобождается и. реакция замещения повторяется с новым мономером. Скорость взаимодействия таких мономеров сильно зависит от длины фосфотиоатного компонента)

2 -дезокси" й-ацилнуклеоэид (или олигодеэокситионуклеотидил)"3 -фосфотиоата и уменьаается с увеличением длины последнего P Jyif23.

Недостатками известных соединений являются: недостаточно высокая скорость взаимодействия с литиевыми

1 солями 2 -дезокси-М-ацилнуклеоэид

/ (или олигодезокситионуклеотидил) -3 .

-фосфотиоатов в диметилформамиде; уменьщение скорости реакции таких

3 96018 соединений с олигодезокситионуклеотидил-3""фосфотиоатами при увеличении длины последних, уменьшение скорости

I реакции таких мономеров с солями 2/

-дезокси-N-ацилнуклеозид-3 -фосфотио- атов при замене в них катионов лития на катионы тетра-н-бутиламмония, хотя использование последних необходимо для улучшения растворимости реагентов в диметилформамиде и повышения их ip реакционной способности.

Последние два недостатка делают практически нереальным синтез олигодезокситионуклеотидов, содержащих более 12 нуклеотидных остатка. 15

Целью изобретения является новые

5 -йодпроизводные дезокситионуклеотидов, которые по сравнению с известными представителями этого ряда при использовании в качестве мономеров Zp

1 для синтеза олигодезокситионуклео тидов проявляют наибольшую реакционйую способность, не снижающуюся при увеличении длины реагирующих с ними солей 2, -деэокси-N-ацилолиготионуклео тидил-3 -фосфотиоатов или при замене в них катионов лития на катионы тетра-Н-бутиламмония.

Цель достигается свойствами новых йодпроизводных дезокситионуклеотидов общей формулы ! о o uH

Р I о" з вЂ” с,н - с о где В - тимин, й"- анизоилцитозин, 40

N - бензоиладенин, N - изобутирил2 гуанин.

Отличие настоящих соединений от известных заключается в наличии положительно заряженного структурного фрагмента, а именно N, N, N,N -диэтилметилариламиногруппы, что придает им новые свойства. В результате взаимодействия с собственным отрицательно заряженным остатком фосфотиоата они образуют нейтральные внутренние соли, не сорбирующиеся ни катионо-, ни анионо-обменниками.

Наличие нового структурного фрагмента резко повышает реакционную спо- >> собность предлагаемых соединений при получении олигодеэокситионуклеотидов, при этом происходит увеличение ско8 4 рости реакции как с литиевыми, так и с тетра-И-бутиламмонийными солями

2 -дезокси- -ацилнуклеозид-3-фосфотиоатов.

Скорость реакции соединений общей формулы Il с увеличением длины реагирующих с ними олигодезокситионуклеотидами,с 3 -фосфотиоатной группой остается постоянной при увеличении длины последних.

Синтез соединений общей формулы 11 основан на известной реакции алкилирования (? ) и заключается в алкилировании дилитиевых солей 2 -дезокси-N-ацилнуклеозид-3 -фосфотиоатов йодидом

2"бром-$Ngln -диэтилметиламино -фенил) пропионамида в диметилформамиде с последующим йодированием образующегося продукта йодидом метилтрифеноксифосфония и выделением известными мето. дами.

1 )1

Пример 1. 2,5 -Дидезокси-5

-йодтимидин" 3 -S-2- М -(n-диэтилметилами но1-фенил)карбомоилэтилфосфотиоат (11 а) .

К раст вору тимидин- 3 -фосфотиоат а, дилитиевой соли, дигидрата (0,386 г, 1 ммоль) в 2 мл диметил юрмамида прибавляют йодид 2-бром jM -(и -диэтилметиламино -пенил) пропионамида (0,53 г„

1,2 ммоль1; После растворения последнего выдерживают еще 2 мин, упаривают в вакууме с пиридином (3x10 мл ), один раз с толуолом (10 мл) . Масло обрабатывают l И раствором йодида трифеноксиметилфосфония (1,2 мл), выдерживают

10 мин и продукт осаждают 50 мл ацетона, осадок отфильтровывают, промывают ацетоном (Зх10 мл) и высушивают. Получают О,б45 г (11 а)(953) хроматографически гомогенного продукта.ТСХ на силуфоле в системе хлороформ -метанол вЂ” 0,5 M ацетата аммониявЂ”

10 20:2 (А). Кинетически чистый продукт волучают пропусканием раствора продукта в 503-ном спирте через колонку, содержащую 5 мл дауэкс 50 (Li-форма) и 5 мл дауэкс 1 (С1=форма), элюцией 50/-ным спиртрм, упариванием элюата до объема 0,5 мл и нанесением на колонку, содержащую 1 л сефадекса G-15 файн. После элюции водой получают 12200 о.е. при

= 267 нм, После упаривания в вакууме и осаждения иэ метанола (2 мл) в эфир (100 мл) с последующим центрифугированием осадка, получают 0,54 r (803) продукта. УФ-максимум в воде 252 нм (E 21000), УФ-минимум - 227 нм

5 9601 („ -- 8500). Реакция двукратного избытка 11а с ди- Bu tl+-солью тимидинI о

-3 -фосфотиоата при 20 С в диметилформамиде заканчивается менее, чем за 1 мин. Защита с тиофосфатной груп пы отщепляется в 1 М гидроокиси лития при 20 С полностью за 25 мин, о при этом образуется 2,5 -дидезокси-5 -йодтимидин-3 -фосфотиоат и М-(иI 1 диэтилметиламино) -фенилакриламид, Пример 2. 2,5 -Дидезокси-5 -йод-N -анизоилцитидин-3 -S-?-f.é(. 4

- (И-диэтилметилами но) Фен ил,1 нарбомоилэтилфосфотиоат (11 д1.

Алкилирование 2 -дезокси-gl -аниI

I зоилцитидин-3 -фосфотиоата, дилитиевой соли, дигидрата (0,505 r, 1 ммол ) в диметилформамиде (2 мл) йодидом

2-бром-(й-(, и-диэтилметиламино) фенил пропионамида (0,53 г, 1,2 ммоль) с 20 последующим йодированием йодидом трифеноксиметилфосфония (1,2 ммоль) в условиях примера 1 дает после гельхроматографии на 1 мл сефадекса G-15 в 153-ном спирте 0,65 r (82 ) внутрен ней соли 11 б, гомогенной при ТСХ в системе А. Уф-максимум в воде 302 нм (E g= 25000 и 252 нм 2 1= 28900

Уф-минимум - 235 нм (C = 21500) и 280 нм (Е = 20800 ). Так же как и 30 (11 а), 11 6 реагирует с ди-Bu M+солью тимидин-3 -фосфотиоата менее, I» чем за 1 мин, гидролиз защиты с фосфотиоатной группы также заканчивается за 25 мин, давая 2,5 -дидезоксиft

-5"-йод- йанизаилцитидин-3 "Фосфотиоат и Й -(И -диэтилметиламино) -фенилакриламид.

П р и и е р 3. 2,5 -Дидезокси-5 -иод-й (-бензоиладенозин-3 -5-21Ю-(И-диэтилметиламино) фенил)"карбомоилэтилфосфотиоат (11 в).

Алкилирование 2 -деэокси- М -бензоI иладеноэин-3 - фосфотиоата, дилитиевой соли, дигидрата (0,499 r, 1 ммоль) в диметилформамиде (3 мл) йодидом

2-бром- Н-(И-диэтилметиламин4 фенил 1 пропионамида (0,53 г, 1,2 ммоль) с последующим йодированием йодидом три- феноксиметилфосфония (1,2 ммоль) в условиях примера 1 дает после гельхроматографии на 1 л сефадекса 9 -15 в 103-ном спирте и осаждения из метанола (3 мл) в эфир (200 мл) 0,6 г .(764) внутренней соли 11 в, гомоген. ной при ТСХ в системе А.

УО-максимум в воде 252 нм (Я = 29500) и 280 нм (f = 20900), УФ-ми. нимум-227 нм (E. = 20300) и 272 нм(с

88 d

= 20500). Реакция НЯ с дитетрабутил-. аммонийной солью тимидин-3 "фосфотиоата заканчивается за 5 мин в условиях примера 1, щелочной гидролиз протекает с такой же скоростью, что и для

Пц, давая 2,5 -дидезокси-5 -йод.-Й -6енэоиладенозин-3 -фосфотиоат и

04-(И -диэтилметиламино)фенилакриламид.

Пример 4. 2,5 -Дидезокси-5 I

-йод-й -изобутирилгуанозин-3 - -2ф4-(И -диэтилметиламино)фенил)карбомоилэтилйосфотиоат (11 ) .

Алкилирование 2 -дезокси- Й -изобутирилгуанозин-3 -фосфотиоата; дилитиевой соли, дигидрата (0,481 r, .1 ммоль) в диметилформамиде, (3 мл) йодидом 2-бром И-(II-диэтилметиламино) фенил пропионамида (0,53 г, 1,2 ммоль) с последующим йодированием трифеноксиметилфосфоний йодидом (1,2 ммоль) в условиях примера 1 дает после гель" хроматографии на 1 л сефадекса 6-15 в 103-ном спирте и осаждения из метанола (2 мп) в эфир (100 мл), 0,61 г (793) внутренней соли (11< ), гомогенной в системе А.

УФ"максимум в воде ?55 нм. (f =

= 242000) и плечо 280 нм (Я.= 126000), УФ-минимум - 226 нм (Е = 10700) . Pe" акция 11 . и дитетрабутиламмонийной соли тимидин-3 -фосфотиоата в условиях примера 1 заканчивается за 5,5 мин, щелочной гидролиз протекает с такой же скоростью, что и дпя ИО давая

2 (,5 -дидезокси-5 -йод-И -изобутирилI I гуанозин-3 -фосфотиоат и N(-n --диэтил. метиламино)фенилакриламид.

Иономеры общей формулы 11 были использованы для синтеза гексадекадезок" ( ситионуклеотида А состава 2- с1- ((Cps), Aps Т -(Cp+3< (Тр ) + (СРв)1 Л pr (Т 6 .

Выход А составил 17 мг (163 в расчете на исходный мономер или 89 на стадию) после выделения ионообменной хроматографией и Очистки гель-хроматографией. Хроматографические харвктеристики соответствовали 15-зарядному веществу, При неполном ФДЭ-гидролизе был получен набор олигомеров, число которых соответствовало длине А, а при исчерпывающем гидролизе ФДЭ были получены продукты, по подвижности соответствующие мономерам.(А ) коли" чественно фосфорилировался при обра" ботке полинуклеотидкиназой фага Т и ф р=ЛТФ. Анализ ФДЭ-гидролизата А модифицированным методом Сэнжера дает структуру, совпадающую со структурой

А, 960188

Время реакции, мин указанного.мономера с тимидин-3 "-фосфотиоатом (TpS) в диметилформамиде при

20 С (993 превращения) Известные соединения Предлагаемые соединения общей формулы 1 общей формулы 11 (g )Тр (В) {-.1 ) Т (3 ) 82Арз (R) (a) ЬАрз(4 ) (1 (g ) Трз (R) 40

160

П р и м е ч а н и е. (l)Tps(R) - 2,5 -дидеэокси-5 -йодтимидин-3 - 6 - 2-цианэтилйосфотиоат;

У д / (1)bzAps(Р) - 2,5 -дидезокси-Й-бензоил-5йодаденозин- 3 -5-2-цианэтилфосфотиовт; (Э)1- 2,5 -дидеэокси-5 -йодтимидин.

Формула и зобретения

QN rO ga

О CC рН -С О

Составитель Л. Никулина

Редактор О. Половка Texpeg М.ТепеР Ко некто H. КоРоль

Заказ 7140/28 Тираж 388 - Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035 Москва, Н-35 Раушская наб, g. 4/g

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Полученный гексадекатионуклеотид по структуре является частью гена анвЂ” гиотензина 1 и "сшивается" полинукле" отидлигаэой фага Т 1 на кислородной матрице с соответствующим кислородным s блоком.

Использование соединений общей формулы 11 для синтеза олигодезокситио" нуклеотидов показало, что они являются более эффективными мономерами, 10 чем ранее известные и обладают .следую" щими преимуществами: увеличение скорости взаимодействия с литиевыми солями 2-дезокси-Й-ацилнуклеозид (или олигодезокситионуклеотидил);3"-Фосфо- 15 тиоатов в 4 раза, а с тетрабутилам- -вЂ”

Йодпроизводные дезокситионуклеотидов общей формулы монийными - в 20 раэ в сравнении с известными соединениями; независимость скорости взаимодействия предпагаемых соединений от длины реагирующих с ними солей 2-дезокси-Й-ацил-олиготионуклеотидил-3 -фосфотиоатов, что практически снимает ограничение длины целевых олигодеэокситионуклеотидов, синтезируемых при помощи таких мономеров.

Данные, полученные при использовании соединений общей формулы ll в синтезе олигодеэокситионуклеотидов, в сравнении с известными соединениями сведены в таблицу. где В - тимин, g4 вЂ” анизоилцитозин, Я6" бенэоиладенин, Й вЂ” изобутирилгуа" нин, как мцномеры для синтеза олигодезокситионуклеотидов.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Авторское свидетельство СССР по заявке Ю 2405856/23-04. 1976.

2. Сода A.F. Синтез нуклеозидов.

I Amer. Chem. Soc., m. 92, с. 190 ,1970.