Способ получения поливалентного панкреатического ингибитора, обладающего антикининогеназным действием

Способ получения поливалентного панкреатического ингибитора, обладающего антикининогеназным действием

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

описание

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Союз Советских

Социалистических

Республик («>960190 (61) Дополиительиое к ввт. свид-ву (22)Заявлено 17.03.81 (2l) 3264578/23-05 с присоединением заявки И (5I)M. Кя.

С 08 В 37/02

А 61 К 37/64

9мудеретееныб квинтет

СССР. вв далем нзобретенив и открытий (23) Приоритет 04.09.79 (53) УДК 547.458..8. (088.8) Опубликовано 23.09.82. Бюллетень М 35

Дата опубликования описания 25.09.92. е

И. В. Березин, В. В. Меньшиков, Н. Ф. Казанская

Н.И.Ларионова, $. Â.Áåëÿêoâ, И.Ю. Сахаров, А

В.Г. Владимиров, В. И. Сергиенко и В.К.Гостищ (72) Авторы .изобретения

1-ый Московский ордена Ленина и ордена Тру

Знамени медицинский институт им. И.М. Сечен государственный ордена Ленина и ордена Труд

Знамени университет им. М. В.Ломоносова (71) Заявители (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИВАЛЕНТНОГО

ПАНКРЕАТИЧЕСКОГО ИНГИБИТОРА, ОБЛАДАЮЩЕГО

А НТИКИНИНОГЕНАЗНЫМ ДЕЙСТВИЕМ

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, в частности к способу получения вещества, обладающего антикининогеназным действием, и может найти. применение в медицине.

Молекула поливалентного панкреатичеокого ингибитора кининогеназ (ППИК), выделенная из поджелудочной и околоушной желез и легких крупного рогатого скота, состоит иэ 58 аминокислотных остатков. ППИК широко применяется в медицине в качестве лекарственного средства (гордокс) при лечении ряда заболе ваний, сопровождающихся избыточным образованием биологически активных полипептидов — кининов 11).

Недостатком известного средства является кратковременное действие, связанное с быстрым выведением его из организма. .Время полувыведення гордокса зависит от дозы и составляет 30-70 мин. Целью изобретения является получение целевого продукта, обладающего длитель ной антикининсгеназной активностью.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения поливалентного панкреатического ингибитора, обладающего антикининогеназным действием, включающему выделение ингибитора из организма крупного рогатого скота, 1 - 8 вес.ч. поливалентного панкреа тического ингибитора дополнительно обрабатывают раствором -смеси карбоксм, метилдекстрана и l TKH»3-(3 «диетил

I аминопропил) карбодиимида при их соотношении 2,5-10:5-10 при рН 4,7-7,6 и 20»25 С.

Ф

Следует отметить, что только испол зование карбоксиметилдекстрана приводит к пролонгированию действия ППИК, другие же полисахариды, такие как декстран и ДЗАЗдекстран, приводят к получению продуктов, содержащих 0,2-1% белка в препарате с сохранением менее 10% ингибирующей активности, тогда как карбоксиметилдекстран приводит к продукту, содержащему 20-50% белка от веса препарата с полным сохранением кинематичесМ0100 ких и равновесных констант в модельной реакции ассоциации с трипсином.

Структура нового производного ППИК индивидуального полимерного продукта, полученного химическим путем ацилирова- S нием карбоксиметилдекстраном, в присутст» вии карбодиимида, подтверждена химическими и физико-химическыми методами.

Образование связи с носителем доказано . измерением количества модифицированных >6 аминогрупп ППИК., Реакция с тринитробензолсульфокислотой показывает, что при ацилировании

KN-декстраном вступают в реакцию .две аминогруппы белка, Выделение препарата

ППИК, связанного с карбоксиметилдекст - раном, проводилось методом, гель-хроматографии, в основе которого лежит разделение веществ с различными величина-; ми молекуля рных весов. Хроматографически ® выделенный пик высокомолекулярного вещео тва содержит белок, определенный известным методом Лоури, и полисахарид, определенный по цветной реакции Дюбуа.

Новое производное ППИК сохраняет биологическую активность - является ингибитором кининогеназ, но в отличие от исходного продукта - ППИК обладает пролонгированным действием, что подтверждено на модели острого панкреатита у собак данными rio выживаемости и средней продолжительности жизни.

Пример 1. 200 мг КМ-декстра на (ст.з. 0,6; средний М1 6-10 )

4 растворяют В 1 0 мл 0 1 М раствора 3$ хлористого натрия и добавляют 200 мг

1-етил-3 (3 -диэтиламинопропил) карбодиимида, рН реакционной смеси поддерживают 4,7 в течение 30 мин. Затем к реакционной смеси добавляют 100 мг eg

ППИК, смесь инкубируют при рН 5,7 в течение 16-24 ч при 20 С, ППИК, связанный с КМ-декстраном, отделяют от нативного белка гелтхроматографией реакционной смеси на колонке с сефарозой41 6&-Сl (25 v 400 мм), уравновешенной

O„1 М раствором хлористого натрия при рН 5,7. За хроматографическим разделением следят по изменению оптической плотности при 230 и 206 нм. Первый . пик, соответствующий высокомолекулярному производному ППИК, обессоливают на колонке с сефадексом G-25 (25 . 6OO мм), уравновешенном 5%-ным раотвором уксусной кислоты. Обессоленный препарат лиофильно высушивают и опре. деляют в нем содержание белка по. мето ду Лоури и ингибирукяцую активность по отношению к трипсину. Полученное водорастворимое соединение ППИК с КМ-дек,етраном содержит 30% белка от сухого веса препарата и сохраняет 75% ингибирующей активности по отношению к трипсину.

Пример 2. 52 мг KM-декстрана (cr.з. 0,6; средний N7" = 6 10 ) растворяют в 10 мл 0,1 М раствора хлорида натрия и добавляют 200 мг 1-етил«3(3 диэтиламинопропил) карбодиимида, рН реакционной смеси поддерживают 5„7 в течение 30 мин. Затем к реакционной смеси добавляют 160 мг ППИК, смесь инкубируют при рН 5,7 В течение 1624 ч при 28 С.

Выделение ППИК, связанного с КМдекстраном, аналогично примеру 1 . Полученное водорастворимое,соединение ППИК с КМ-декстраном содержит 50% белка or сухого веса препарата и сохраняет 60% ингибирующей активности по отношению к трипсину.

Пример 3. 200 мг КМ-декстрана (ст.з. 0,6; средний М „= 6 10 Р) раотворяют в 10 мя ряотворя 0,1 M Ne(X и добавляют 100 мг 1-атил-3(3 -диэтиламинопропил) карбодиимида, рН реакционной смеси поддерживают 7,6 в течение

30 мин. Затем к реакционной смеси добавляют 20 мг ППИК, смесь инкубируют при рН 5,7 в течение 16-24 ч прн 20 С.

Выделение ППИК, связанного c KN-декстраном, аналогично примеру 1. Полученное водорастворимое соединение ППИК с

КМ-декстраном содержит 20% белка от сухого веса препарата и сохраняет 100% ингибирующей активности по отношению к трипсину.

П p H м е р 4. Испытание антикнни-. ногеназной активности полученного соединения. Высокая биологическая актив ность и цролонгированность действия

ППИК, сВязанного с КМ-декстраном, подтверждена данными о выживаемости и средней продолжительности жизни собак при экспериментальной форме острого панкреатита.

Острый панкреатнт воспроизводился введением в главный панкреатический проток инкубационной смеси желчи с трипсином. Через 3 ч:в вену задней конечности вводят предлагаемое вещество. В экспери менте выделенб две контрольные группы животных: первую составили 11 собак, у которых лечение не проводилось; вторую1 1 собак, у которых острый панкреатит протекал на фоне применения поливалентно."

5 060100 го ингибитора кининогеназ в виде лекарственного препарата - гордокса.

Результаты эксперимента представлены в таблице.

Средняя продолжительность жизни по» гибших животных, дн.

Выжившие животные, %."

В ещество, применяемое при лечении животных

Доза вещества

Количест во живот ных

0 т

5 000 кие/кг

Гордокс

14

5 000 кие/кг

ППИК, связанный . с КМ-декстра ком!

Составитель Т. Мартинская

Редактор О. Половка Техред М.Тенер Корректор; Н. Король

Заказ 7141/28 Тираж 514 . Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-З5, Раушская наб., д, 4/5

Филиал ППП Патент, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Таким образом, предлагаемый способ шийся тем, что, с целью получения . позволяет получить препарат поливалент» целевого продукта, обладающего длитель ного панкреатического ингибитора кини- ной антикининогеназной активностью, 1 ногеназ, обладающий пролонгированным 8 вес.ч. цоливалентного панкреатического действием по сравнению с известным. З ингибитора дополнительно обрабатывают, раствором смеси карбоксиметилдекстрана и 1-этнл-3-(3 -диэтиламинопропил) карбоФ о р м у л а и з о б р е т е н и я диимида при их..соотношении 2,5-10.: ° 5l0 при рН 4,7 - 7,6 и 20«25 С.

Способ получения поливалентного пан- Источники информации, креатического ингибитора, обладающего принятые во внимание при экспертизе антикининогеназным действием, включаю-. Ь.ЧодеВ R.,%å.áe E. Ко®Ь"ею юй1Ъ1щий выделение ингибитора из организма. ого.НаицЬооМ о% Евра опенка Р9сн-и окрупного рогатого скота, о т л и ч а ю 2080Q ÷..Ъег ®,1970 (npoTOTun).