Способ определения фракционного состава растворимых белков кожи

Способ определения фракционного состава растворимых белков кожи

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

(») 960625

ОП ИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ . К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Союз Соввтскмн

Соцмалмстмчвс ими

Рве лтт блик (61) Дополнительное к авт. саид-ву(22)Заявлено 25.03,80 (2! ) 2898581/28-13 с присоединением заявки Эв (23)приоритет (5! )М. Кл.

G 01 В 33/48

G 01 и 27/26

3Ьеударетвенный квинтет

CCCP ае аваам нэойретеннй и ютнрытнй (53) УЛК 543 545:

:543.865 (088 ° 8) ОпУбликоваио 23. 09. 82 . Бюллетень Ют

Дата опубликования описания 23 .09 .82

С. В. Кириллов, И. С. Старостина, Н. И.Иакарев и Е.К.Богданова (72) Авторы, изобретения

Хабаровский научно-исследовательский инст эпидемиологии и микробиологии и Хабаровск государственный медицинский институт (7I ) Заявители

1 (54) .СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФРАКЦИОННОГО СОСТАВА

РАСТВОРИИЫХ БЕЛКОВ КОЖИ

Изобретение относится к медицине, в частности к способам исследования кожи.

Известен способ определения фракционного состава расторимых белков кожи путем ее гомогенизации., экстрагирования фосфатным буфером в течение 1 сут и центрифугирования с последующим разделением белковых фракций в .супернатанте методом искэлектрофореза в полиакриламидном геле. Способ дает возможность выявить

6-8 белковых фракций в нормальной и до 18 фракций в патологической коже 11).

Однако известный способ не позволяет получить более полного представления о спектре растворимых белков кожи, что важно при диагностике различных патологий кожи.

Цель изобретения - выявление больше ro числа фракций, т .е. наиболее полного состава (25-29 фракций) растворимых белков кожи .человека и сокращение продолжительности процесса.

Указанная цель достигается способом определения фракционного

5 состава растворимых белков кожи, включающим гомогенизацию пробы, экс" тракцию белков и центрифугирование с последующим разделением белковых фракций в супернатанте методом дискэлектрофореза в полиакриламидном геле, согласно которому гомогениэацию пробы ткани проводят одновременно с экстракцией в присутствии кварцевого песка и физиологического раствора в соотношении 2: 1:4 в течение 20-25 мин, а центрифугирование осуществляют в течение 40-45 мин .при 8000 об/мин.

Кроме того, диск-электрофорезу подвергают пробу супернатанта, содержание белка в которой составляет

600-1000 нг.

Табли ца 1

Пробы - образцы

Содержание белка

4,68

4,36

4,29

4,82

4360

4290

4680

4820

1800

2400

1800

2400

600

800

800

600

3 9

Процесс обработки пробы и выявление фракционного состава белков ве дут на холоду (0-4 С)

Разделение белков кожи на фракции проводится известным методом в ПААГ

$2), но в подготовку пробы белков кожи (экстракта белков кожи) внесено ряд существенных изменений, влияющих на конечные результаты этого известного метода.

Для полуумения экстракта (или супернатанта) в достаточном количестве для исследования с нужным содержанием белков (не менее 4-5й) необходимо растирать ткань с квар.цевым песком и физиологическим раствором в определенном соотношении о

2: I:4 в течение 20-25 мин при 0-4 С.

При растирании ткани менее 20 мин гомогенизат неоднороден и с .низким содержанием белков. При более длительном растирании на старте гелефореграммы появляется денатурируемый белок.

Важную роль для получения положительного эффекта оказывает прием центрифугирования гомогенизата.

Наилучшим вариантом является центрифугирование при 8000 об/мин в течение 40-45 мин.

При меньших оборотах центрифуги не успевает формироваться плотный осадок, . в результате чего супернатант мутный, что мешает его дальнейшему исследоваВ неразведенном супернатанте, г

В 01, мл неразведенного супернатанта, нг

В 01, мл супернатанта, разведенного физраствором, нг

В О,1 мл супернатанта разведенного физраствором и крупнопористым гелем, нг

60625 ф нию. При более продолжительном времени центрифугирования появляется денатурированный белок на старте.

Одним из основных условий наи лучшего выявления различных белковых фракций является достаточное содержание белков в исследуемой пробе.

Оптимальным содержанием белков в пробе является 600- 1000 нг. При

Iy более низкой концентрации снижается количество выявляемых фракций, а при более высоком содержании затруд няется разделение белковых фракций.

Пример. К 0,5 г охлажденной кожи человека, взятой послойно (эпидермис, дерма.и цельная кожа) на всю толщину электродерматомом у лиц, подвергшихся оперированию (эппендэктомия, грыжесечение), предварительно отмытой физиологическим раствором от крови, измельченной и помещенной в фарфоровую ступку, добавляют 0,25 г кварцевого песка и

2 мп охлажденного физиологического раствора и гомогенизируют на холоду о (0-4 С) в течение 20 мин, после чего гомогенизат количественно переносят в центрифужные пробирки и центрифугируют при 8000 об/мин в течение 40 мин. В полученном супернатанте определяют содержание бел ка по методу Лоури.

Содержание белка в различных пробах-образцах приведено в табл. 1.

2 3 4

Белковые зоны

Пробы-образцы кожи (R ) (3 1 4

0 0 (2 пристартовая

0,02

0,02

0,02

0,03

0,03

0,03

0,06

0,06

0,06

0,06

П пристартовая

0,09

0,09

0,09

0,09

Медленные пострансферрины

0,12

0,12

0,12

0,15

0,15

0,18

0,15

0,18

0,18

0,21

0,21

0,21

0,26

0,26

0,32

0 32

0,44

0,44

0,44

0,53

0,54

0,53

0,67

0,67

0,67

5 9606

Исходя из количественного содержания белков в супернатанте разводят его физиологическим раствором (табл. 1) с таким расчетом, что в о, l мл раствора содержится 1800-2400 нг 5 белка. Затем смешивают разведенный супернатант с раствором крупнопористого геля в соотношении l: 3 (к О, 1 мл разведенного супернатанта 0,.3- мл крупнопористого геля), после чего 10 в 0,1 нг смеси содержится 6001000 нг белков (табл., 1). Это количество наносят на трубочки с полиакриламидным гелем для разделения на фракции. Разделение (фракцирова- ss ние) белков проводят на приборе для диск-электрофореза фирмы "Реанал", согласно известной методике (2) в холодильной камере (4 С). Сила тока в первые 30 мин не должна превышать 20

2 MA на трубочку, затем ее увеличивают до 4 HA на трубочку.

После.электрофореза гелевые столбики извлекают из трубочек и доме25 6 шают на 20 мин в пробиркиес раствором красителя и фиксатора (амидочерный 10 В в 73-ном растворе уксусной кислоты).

После окрашивания гелевые стол" бики многократно отмывают 74-ным раствором уксусной кислоты до полного вымывания красителя, не связанного. . с белками.

На отмытых гелефореграммах всех четырех проб-образцов кожи было выявлено 25-30 фракций (табл. 2).

Предлагаемый способ дает возмож- . ность получить в пробе супернатанта белка 600-1000 нг, а при разде-. лении этих проб методом диск-электрофореза в полиакриламидном геле выявить 25-30 белковых фракций с определенной электрофоретической подвижност ью.

Распределение белковых зон и отдельных фракций на гелефореграммах различных проб - образцов нормальной кожи человека показано в табл. 2.

Таблица 2

960625 8

Продолжение табл. 2

Пробы-образцы кожи (R ) белковые эоны

1 3 f 4

Быстрые пострансферрины

0,78

0,73

0 75

0,73

0,82

0,85

0,85

0,85

Трансферрин

1,18

1,18

1,18

1,18

Постальбумины I 21

1,21

1,26

1,26

1,26

1,26

1,32

1,36

1,32

1 32

1,44

1,42

1,42

1,44

1,56

1,56

1,56

1,56

1,62

1,62

1,62

1 76

1 74

1 76

1,75

1,82

1,82

1,82

1,89

1,89

1,89

1,89

Альбумины

2,12

2,12

2,12

Преальбумины

2,25

2,26

2,26

2,25

2,35

2 35

2,35

2,35

2,59

2,59

2,59

2,59

2,62

2,63

2,62

Итого

30

На чертеже приводится схема расположения на гелефореграммах выявленных белковых фракций нормальной кожи.

Использование изобретения перопективно для оценки состоянИя защитных механизмов в преморбидном состоянии 5$ и при .различной патологии кожи.

Технико-экономическая эффективность изобретения заключается в том, что предлагаемый способ позволяет упростить процесс .и одновременно выявить большее количество белковых фракций (до 29),что позволит по изменению состава фракций растворимых белков:кожи в патологии установить индивидуальные особенности различных кожных заболеваний. Продолжительность процесса сокращается до 1 ч.

9606

3оии

А20

8,70

ВНИИПИ Заказ 7253/50 Тираж 887 Подписное филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул. Проектная, 4

Формула изобретения

1. Способ определения фракционного сотава растворимых белков кожи путем гомогенизвции пробы ткани, экстракции белков и центрифугирова- 5 ния с последующим разделением белковых фракций в супернатанте методом диск-. электрофореза в полиакриламидном геле, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью выявления боль10 шего числа фракций и сокращения продолжительности процесса, гомогенизацию пробы ткани проводят одновременно с экстракцией в присутствии кварцевого песка и физиологического 1S раство. в соотношении 2: 1:4 в течеwe 20-25 мин, а центрифугирование

25 1О осуществляют в течение 40-45 мин при

8000 об./мин.

2. Способ по и. 1, о т л и ч аю щ и и .с я тем, что пробу супернатанта, подвергаемую диск-электрофорезу, используют при содержании в ней белка 600- 1000 нг.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Ежова Г.П., Добротина Н.Я. и

Денисов В. М. Клини ка, патогенез и терапия кожных болезней. Труды Горьковского мединститута, 1976, с. 21-25

2. Davis В.G., Omstein L. А new

high resolution elect ãîð1iîãåû s

method.-"Del1ivat Soc. for the study

of 81eod at New-Jork Асад. med.,1959.