961565 - Способ получения мукополисахаридов

Способ получения мукополисахаридов

Иллюстрации

Показать все

Реферат

(«>$61565

ОП ИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

К ПАТЕНТУ

Союз Советских

Социалнстнчесннх

Республик (61) Дополнительный к патенту (22) Заявлено 20. 01. 77 (21) 2442434/28" 13 (51) M. Кл.

С 12 P 19/00

С 12 P 21/00

С 12 и 1/645 (23) Приоритет - (32)ГОсуАврстихкый KoMNToT

CCCP

50 делам хзш1ретвнив и вткрытий (31} (ЗЗ), Опубликовано 23. 09.82. Бюллетень М 35 (БЗ) УДК663.15 (088. 8) Дата опубликования описания 25 .09.82

Иностранцы

Тецуя Хотта, Сатору Еномото, Тикао Есикуми, и Сабуро Уено (Япония) (72) Авторы изобретения

Охара

Иностранная фирма

"Куреха Кагаку Когио Кабусики Кайся" (Япония) (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МУКОПОЛИСАХАРИДОВ

Изобретение относится к способам получения мукополисахаридов, обладающих противоопухолевой активностью и представляющих интерес с точки зре-. ния использования их в медицине 5

Известен способ получения мукополи" сахаридов из грибов базидиомицетов, предусматривающий экстракцию их из мицелия и/или плодовых тел грибов, выбранных из группы, включающей Cori-

olus versicolor (Fr.) Quel., Coriolus

hirsutus (Fr.) Quel., Corio1из pargamenus (Fr.) Pat. водой или горячим водным раствором щелочи при 60-100 С, тк о отделение экстракта, его концентри" рование, высаливание сульфатом аммония, перерастворение осадка и диализ с последующей хроматографической очисткой на ионообменных смолах и в сушкой.

Полученные в результате выделения вещества представляют собой полисахариды, связанные с белками, соотношение полисахаридной и белковой частей находится в определенном интервале.

Эти вещества показывают значительное противоопухолевое или противораковое действие: при внутрибрюшинном введении Pl).

Однако известные вещества оказывают очень слабое противоопухолевое действие при стоматическом введении.

Пбэтому, хотя известные вещества могут представлять большой интерес для научйых исследований, их практическая полезность ограничена.

Целью изобретения является улучшение свойств получаемого продукта, заключающееся в обеспечении возможностей более успешного применения.

Указанная. цель достигается тем, что согласно способу получения муко" полисахаридов, предусматривающему экстракцию их из мицелия и/или плодовых тел грибов базидиомицетов, выбранных из группы, включающей Coriolus

Versicolor (Fr.) Quel.; Coriolus hir-:

5 ф

olus pargamenus (Fr ) Pat - штамм

ГЕРИ-Р и 27i? °

Однако для промышленного производства наиболее выгодно использовать

Coriolus vers color (Fr.) Quel штамм FFPH-Р Р 2412, так как он может обеспечить самый высокий выход предлагаемого вещества.

В качестве исходного материала можно применять как Coriolus versico-

1ог .(Fr.). Quel - штамм ГЕРИ-P У 24122426, так и Согiolus пirsutus (Fr.)

Quel " штамм FEPH-P Ю 2711, и Cori3 96156

sutus (Fr., Quel ., Coriolus pargamenus (Fr.) Pat., с помощью воды или

0,01-0,5 н. водного щелочного раствора при 95-100 С, отделение экстракта, его концентрирование, фракционированное осаждение целевого продукта сульфатом аммония, диалиэ и хроматографическую очистку диалиэата, иэ вида Coriolus versicolor (Fr.) Quei используют штаммы ГЕКИ-P N 2412-2426,-to из вида Coriolus hirsutus (Fr.) Quel штамм FERH-P Р 2711, иэ вида Corio1 us pargamenus (Fr.) Pat. " штамм

ГЕКИ-Р ь= 2712, иэ сконцентрированного экстракта удаляют низкомолекулярные 15 вещества путем добавления сульфата аммония в количестве, соответствующем 1004 степени насыщения, с последующим перерастворением полученного осадка в воде и диализом., фракциони- 20 рованное осаждение сульфатом аммония осуществляют сначала в количестве

2512 .от насыщения с удалением полу.ченного осадка, затем в количестве

404 от насыщения с последующим диапи" и эом, а хроматографическую очистку диализата осуществляют на диэтиламиноэтилцеллюлозе с элюацией 1 н. раствором NaCl, после чего целевой продукт выделяют осаждением сульфатом gy аммония в количестве 403 от насыщения с последующим диализом и сушкой. распылением.

Используемые штаммы депонированы в Научно-исследовательском институте ферментации (Агентство промышленных исследований и технологии) в Японии .

На фиг. 1 графически изображен инфракрасный спектр поглощения предлагаемых веществ - полисахаридов, связанных с белками; на фиг. 2-6 - спектры протонного магнитного резонанса пред" лагаемых веществ.

Иукополисахариды, полученные предлагаемым способом, более эффективны при подавлении образований из переса" женных опухолевых клеток. на подопытных животных по сравнению с продуктом, полученным в соответствии с известным chocoGOM при стоматическом при-" .менении.

Результаты сравнения противоопухолевых активностей приведены в табл.1 °

Способ осуществляют следующим образом.

Грибы-продуценты предварительно выращивают и мицелиальную пленку, выросшую на поверхности питательной среды, гомогенизируют физиологическим раствором, чтобы получить посевной материал для производства культу ры. Посевной материал подвергают ста ционарному выращиванию или выращиваwe погружением для развития. грибницы, которую экстрагируют, применяя водный растворитель " горячую воду или. разбавленный щелочной раствор.

Полученный экстракт после, удаления иэ него остатка от экстракции концентрируют и затем подвергают высаливанию сульфатом аммония или ультрафильтрации для удаления низкомолекупярных веществ. Очищенный таким обра" зом экстракт концентрируют до 5-103 по весу. В этот концентрированный раствор затем добавляют сульфат аммония в количестве,. соответствующем

253 от величины насыщения, с целью проведения Фракционированного осаждения, и удаляют образовавшийся осадок.

В полученный раствор снова добавляют сульфат аммония в количестве, соответствующем 403 величины насыщения, и подученный..осадок собирают. Собранный осадок растворяют в воде и обессоливают с помощью диализа. Образовавшийся раствор пропускают через кколонку с ДЭАЭ-целлюлозой и вещество, адсорбированное на колонке, промывают водой и затем вымывают 1 н. солевым раствором. В полученный элюат снова добавляют сульфат аммония в количестве, соответствующем 403 величины насыщения, для получения осадка.

Полученный осадок снова растворяют в воде и затем обессоливают с помощью диализа. Полученный очищенный продукт высушивают.

Характерные свойства предлагаемого вещества.

Цветные реакции.

Испытания на цветные реакции проводят с водными растворами предлага5 9615 емого вещества и получают результатУ; ,представленные в табл. 2. Из приведенных результатов испытаний на цветные реакции очевидно, что предлагае. мое вещество содержит сахариды и белок. s

Растворимость.

Получаемые вещества растворяются .а воде и почти не растворяются в ме,таноле, пиридине, хлороформе, бензоле и гексане.

Гигроскопичность.

Для определения гигроскопичности предлагаемого вещества несколько образцов помещают в эксикаторы, s каждом из которых поддерживается эадан1$ ная относительная влажность (табл.3) с помощью насыщенных растворов солей„ и содержание влаги в каждом образце определяют, измеряя изменение веса со временем.

Изменение поглощения влаги со . временем при каждой относительной влажности представлено в табл, 3, Применяемым насыщенным раствором для 32ь относительной влаиности служит насыщенный раствор хлористого нат рия и азотнокислого калия; для 52 . ,относительной влажности " насыщенный .раствор двухромовокислого натрия; для

793 относительной влажно:ти - насышензз. ный раствор хлористого аммония; для

98ь относительной влажности - насыщен-; ный раствор аэотнокислого свинца.

65 6 ток в бромистом калии, показан на фиг. 1. Широкую полосу поглощения при 3600/3200 см относят к 1ОНгрупп, которые в различной степени вступают в водородную связь. Это можно объяснить тем, что широкая полоса поглощения ослабляется или исчезает, когда гидроксильные группы в полисахаридной части образца метоксилиЬуют. Поглощения при 1600 и 1530 см " при-, писывают деформационным колебаниям

-NH и -ИН соответственно. Предположительно такое явление возникает от белковой части образца. С другой сто роны, широкие полосы поглощения при

1200-1000 см рассматривают, как вы,званные несимметричным валентным ко" ,лебанием связи С-О-С в пиранозных кольцах в полисахаридной части. Кроме того, при 890 см- наблюдают харак терный тип поглсщения, возникающий от -связи глюкозы в полисахаридной части, но характеристическое поглоще" ние при 840 см, возникающее от с(-свя-.

Ъи, различают с трудом.

Структура полисахаридной части.

Для определения структурных характеристик полисахаридной .части предлагаемого вещества к образцу весом

10 мг добавляют 33-ный раствор соляной кислоты в метаноле, чтобы выполнить метанолиэ при 100 С в течение

16 ч, и затем, после введения триКак видно из табл. 3, каждый обра-з> зец предлагаемого вещества претерпевает незначительное изменение внешнего вида и расплывания, вызываемого поглощением влаги, не наблюдается.

Величина рН. ,40 рН предлагаемого вещества измеряется при растворении образца весом

1 г в 100 мл воды. Найдено, что оно имеет рН 6,6-7,2. Это указывает на то, что предлагаемое вещество, по"су" ществу, нейтрально.

Оптическое вращение.

Оптическое вращение предлагаемого вещества измеряют, применяя

0,253-ный водный раствор образца,чтобы определить удельное вращение с -Оно находится в области от 0 до 30 и предполагается, что предлагаемое вещество состоит преимущественно из Р -глюкана, удельное вращение которого порядка О.

ИК-спектр поглощения.

ИК-спектр поглощения предлагаемого вещества, измеренный методом таблеметилсилильных групп обычным способом, подвергают гаэохроматографическому анализу. Результаты показывают, что глюкоза составляет более 993 общего количества сахаридов, а другие сахаридные компоненты, такие,какыанноза, галактоза, ксилоэа и фруктоза,,:представлены очень скудно. Для того, чтобы установить тип. глюкозы (О" или

L-r n), кристаллы глюкозы отделяют от продуктов гидролиза предлагаемого вещества. Найдено, что точка плавления отделенной глюкозы находится в области от 143 145 С и когда крис" таллы глюкозы смешивьют со стандартной В-глюкозой, не наблюдается сниже- . ния точки плавления. Поэтому глюкозу, составляющую полисахаридную часть предлагаемого вещества, идентифицируют как О-глюкозу.

Характеристики вида связи сахаридов, составляющих полисахаридную часть.

Положение глюксэидной связи определяют следующим образом.

961565

7 .t

Тйпы связи G (6 вЂ” означает структчрный скелет глюкозы ; вЂ - у

« вЂ” « вЂ” в вЂ” « вЂ” «- G вЂ” и

1ь

- подтверждают из анализа моносах ридов, полученных по методу.окис- 5 ления.периодатом или разложением по способу Смита, и их соотноаение в со-. ставе определяют в опытах по метили,рованию по способу Хеуорса. В процессе идентификации сахариды, получен 10 ные при гидролизе метилированных соединений, идентифицируют с помощью газовой хроматографии как альдитолацетат и .метилглюкозид. Индивидуальные продукты. гидролиза выделяют жид"

15 костной хроматографией на .колонке и. затем кристаллиэуют.или переводят в их кристаллические производные.для подтверждения . Иолярные соотноаения каждой связи в предлагаемом веществе даны в табл. 4, причем молярное содержание G « -связи принято за 1.

Иолярные соотнощения, приведенные ..в табл. 4, определяют по площадям пи-: ков на газовой хроматограмме.альди" толацетата.

Как видно из табл. 4, считается, что полисахаридная часть предлагаемого вещества состоит, главным образом, з 1,4-связей, но в этой полиса- Э© аридной части существуют также и

$-T,3-связи и многие ответвления. На основании этого можно сказать, что полисахаридная часть предлагаемого вещества представляет собой структу- .З5 ру, в которой боковые цепи связаны с главными цепями целлюлозы и сущест вуют отдельные Р-1,3-связи.

Ф.

Характеристики белковой части.

Белковую часть предлагаемого ве- " в щества гидролизуют обычным способом и аминокислоты, составляющие продукты гидролиза, анализируют с помощью анализатора аминокислот.

Содержание аминокислот, составля" ющих белковую часть, вес.Ф:

Еапарагиновая кивяЬв та

Треонин

Серии

Глутаминовая кислота каролин

Глицин

Аланин

Цистеин . Валин

Метионин

Изолейцин

Лейцин 6-8

Тирозин Следы - 3

Фенилаланин 3-6

Триптофан Следы - 2

Лизин 2-4,.

Гистидин Следы - 2

Аргинин 2-4

Аммиак 2-6

Следовательно, белковая часть предлагаемого вещества содержит 18 видов аминокислот, среди которых преобладают кислые и нейтральные аминокислоты, а количество основных аминокислот очень ограничено. Для предлагаемого вещества также характерно, что аспарагиновая кислота, треонин, серин, глу" таминовая кислота, глицин, аланин, валин и лейцйн вместе составляют более 703 всех аминокислот, найденных в белковой части.

Хотя присутствие глюкозамина также подтверждается при аминокислотном анализе, количество этого вещества составляет менее 13 по весу от общего количества белка.

Что касается связи этих аминокислот с полисахаридной частью, предполагается, что аминокислоты прочно связаны с полисахаридной частью в виде олигопептида или пептида.

Это предложение можно вести иэ результатов различного рода испытаний.

При испытаниях по методу Севага, который часто применяют для удаления из образца примеси белка, образцы предлагаемого вещества осадка не об разуют. Для практического осуществления этого метода добавляют 1/5 объема хлороформа и 1/25 объема и -бутанола к водному раствору каждого образца (желательно поддерживать величину рН раствора от 4 до 5) и затем энергично встряхивают смесь. Раствор внимательно рассматривают, чтобы определить, образуется ли какой-нибудь гелеобраэ- ный осадок или нет. Если полисахарид.йая- часть и белок существуют в образце в виде простой смеси, белок денатурируется, образует гель и оседает между слоем воды и слоем хлороформа, но такого осаждения не происходит в том случае, когда полисахарид и балок связаны.

Еще в одном опыте по осаждению, который проводится подобным образом с применением трифтортрихлорэтана, снова не наблюдается образования осадков из обра эцов предла ra емого вещества .

9 961565

Кроме того, образцы предлагаемого та гриба, принадлежащего к Coriolus вещества не показывают изменения со" versicolor (Fr.) Quel, после фильтра- . держания белка в опыте, в котором на ции экстракта под давлением, горяобразцы предлагаемого вещества воз- чей стерилизации и высушивания распыдействуют протеазой " протолитическим лением (такой продукт обозначается энэимом, как Р5-К). Наибольшим различием между

1 \

На основании результатов предыду- P 8 -V."- предлагаемым веществом, как щих испытаний предполагается, что из фиг. 2-6, является то, что в слу" в предлагаемом веществе полисахарид- . чае предлагаемого вещества абсолютно ная и белковая части не просто смеша- не наблюдается поглощения в области юо ны одна с другой, а химически связаны 4,9-6,0 м.д., возникающего из-за друг с другом. 4-связей. Этот факт подтверждает, 4то касается типа связи полисаха- чтополисахаридная часть предлагаемого ридной и белковой частей в предлага- вещества состоит из одного„8-0-глюкана.

И емом веществе, то известны следующие Поглощение при 4,5 м.д. (фиг. 2) типы связи сахара и белка: М-ацил- . относится к р -. (1 вЂ” р 4 ) и р "(1 6 ) гликоэиламинный, О-глюкоэидный и глю- . в протонах метина в 1-ом положении, козидэфирный, но в случае пр длагае" . e то время, как поглощение при мого вещества, в свете тех фактов 4 7 и + связывается с р -(1 вЂ 3) что связи могут с трудом разрушаться „ p,- (1 -+ 2 ) в протонах метина в слабой щелочью и что после гидролиза 1 ом положении. Поэтому можно опредепредлагаемого вещества при анализе лить соотношение р »(1 вЂ” 4) и аминокислот отмечают присутствие глю- р (1, 6) /p - (1 . 3), и козамина, считается, что в предлагае- 1 2) но так как включается

«25

t мок веществе преобладает М-ацилглюко- также разветвленное строение, упомяэиламинный тип связи. нутый метод метилирования должен быть ротонные спектры ядерного магнит- использован ля разъяснения тонкой ного резонанса ЯИР . структуры.

ЯИР (100 ИГц ) предлагаемого вещест- 4то касается белковой части, едва ва измеряют, применяя 8 качестве раст JlH можно считать доказанным строение

30 ворителя тяжелую воду и выбирая в ка- такой белковой части только на осночестве стандар1 а 2,2-диметил-2-силано- вани„измерений спектров ядерного маг. пентан-5"сульфонат натрия (IlCC). Ре.- нитного резонанса. Однако, так как эультаты приведены на.фиг. 2-6. Если предлагаемое вещество показывает по" предполагается, что поглощение от 0,5зз глощение в некоторых, упомянутых ниже, до 2 5 миллионных долей (м д ) по заданных областях, этот метод счита"

ДСС связано с протонами боковых це" ется очень подходящим для идентифика- . пей белковой части, а поглощение от ции предлагаемого вещества.

2 5 до 6,0 м.д. - с протонами поли- . Предлагаемое вещество показывает сахаРидной части, и если свойства .поглощение при 0,9+0 1; 1,2+ 0,1; пРедпагаемого еще в соответствии 2,0+@,1; 4,5+0,1 и 4,7т0,1 м.д., не с приведенными определениями, вы- поглощает в области 4;9-6,0 м.д. и ( ражаются посредством соотношения ин- дает широкую полосу поглощения в обтенсивности сигналов IlpoTOHOB двух ла ти 3,0 4 4 „A. частей, то такое соотношение находит-.is Иолекулярный вес 45 "PH Иолекулярный sec предлагаемого упомянутых измерениях ЯИР для устра вещества, измеренный методом ультра- нения влияния, остаточной легкой воды „ „трифугирования, гаходится в облас в тяжелой воде пользуются величина- .j è 5000-300000 и средний молекуляр" ми после коРРекции в соответствии с ЗВ и ве находится в области 10000допущением кривой лоренца.

100000. Величины, полученные при дру-гих способах определения, таких как

Относительно поглощения полисахариднои части пик поглоще и попа ают в область

2,5-4,1 м.д. возникает благодаря про- рации, также попадают в о ласть тонам метиленовой группы в - и -no-.

2- 6-по-. :10000- 100000. Поэтому можно предпололожениях в пиранозных кольцах цепи жить, жить что с едний молекулярный вес р д сахара. Для сравнения может быть пред- предлагаемого вещества лежит в облас- ложен продукт, полученный из экстрак-,ти 10 ,ти 10000-100000. клетками асцита Эрлиха мышей (ЕС-клетки), ЕС- клетки (5x10 /мл) выращи вают в питательной среде Eagle МЕМ, содержащей 500, 1000 и 2000,й г/мл предлагаемого вещества и 0,5 С/мл Н-уридиили Н-тимидина, при 37 С в течеЭ ние 120 мин. Для контроля вместо предлагаемого вещества добавляют стерильный физиологический раствор. Предлагаемое вещество может уменьшить поглощение Н-уридина PHK ЕС-клеток до

704 от контрольного при содержании предлагаемого вещества 500,0гlмл, через 120 мин, до 653 от контрольного при 1000 аг/мл и до 603 от контрольного при 2000 фг/мл. Предлагаемое вещество может также уменьшить поглощение Н-тимидина ДНК ЕС-клеток

3 до 653 при 500,огlмл, до 603 при

1000,ц г/мл и до 2000 рог/мл, через 120 минут, соответственно.

Испытание противоопухолевой активности in viчо и in ч1tro. (Подавляющая активность предлагаемого вещества против роста клеток асцита Эрлиха).

Исследуется против роста клеток асцита Эрлиха мышей. ЕС-клетки (5x10 клеток/мл) инкубируют в растворе Ханка, содержащем 5000,ог/мп предлагаемого вещества, при 37ОС в течение 3 ч.

После инкубации EC-клетки пересаживают в брюшные полости 1СР-iCL мышейсамок (10 мышей в каждой группе) в количестве 10 клеток на мышь и

6 регистрируют случаи гибели животных в течение 2б дней.

Не наблюдается гибели животных в течение 20 дней после пересадки мышам ЕС-клеток, обработанных предлагаемым веществом, Имеется несколько мышей, у которых отсутствует накопление асцита. С другой стороны, все мыши контрольной группы, которым привиты

ЕС-клетки, погибают от опухоли в течение 20 дней после пересадки.

Испытания противоопухолевой активности in vivo.

Результаты испытаний противоопухолевой активности in vivo на мышах и крысах приведены в табл. 6. Предлагаемое вещество показывает высокую противоопухолевую активность в каждом случае.

Итак, получаемое вещество вЂ” полисахарид, связанный с белками, показывает очень эффективное действие при применении в качестве противоопухолет вого вещества, вводимого стоматически. Предлагаемое вещество, кроме то1! 961565 12

Таким образом, предлагаемое вещество является новым веществом, полученным из полисахаридов, связанных с белками (Р S-К), происходящих из гриба, принадлежащего к Coriolus, и не S содержащим ñ(.-глюкан, согласно измерениям ЯМР, поэтому предлагаемое вещество должно отличаться от P S"К. Вещество легко идентифицировать посредством о точного определения области поглоще" ния при измерениях ЯМР, поэтому тех" ника идентификации, относящаяся к предлагаемому веществу является цен4 ным ориентиром при изучении сложных

15 высокомолекулярных веществ, извлечен-. ных из природных материалов.

Противоопухолевая активность. Испытания острой токсичности на мышах и крысах.

При этих испытаниях используют мышей 1СР-ICL S-rain 4-5-недельного возраста, весящих 21-24 г, и крыс расы

Danrun 4-5-недельного возраста, ве". сящих 100-150 r. Предлагаемое вещест-. во вводят следующими четырьмя спосо-,2S

„бами: внутривенно, подкожно, внутри" брюшинно и стоматически. Через 7 дней после введения вещества проводят на-. блюдения общих симптомов, гибели и веса тела и-после завершения наблюде-Зв ний животных умерщвляют и вскрывают.

Результаты испытаний острой .токсичности на мышах и крысах представлены в табл. 5. Даже введение максимальной дозы не вызывает гибели животных - SS ни крыс, ни мышей, и практически невозможно вычислить величины OLD

Испытания противоопухолевой активности.

Противоопухолевая активность in чЪtro.

Подавляющая активность !и vitro против роста клеток асцитической ге-. патомы AH-13, Исследуют концентрацию

LC, подавляющую рост íà 504 . Пред- лагаемое вещество, последовательно разбавленное, добавляют к суспензии клеток асцитической гепатомы AH-13 и после 48-часового выращивания подсчитывают живые клетки методом окрашивания, чтобы определить подавление роста. Результат показывает, что

LCga предлагаемого вещества составляет 100 мгlмл.

Активность in v tro против роста клеток асцита Эрлиха мышей. Исследуют влияние предлагаемого вещества на поглощение Н-уридина и H-тимидина экстракт и остаток от экстракции, и остаток от экстракции подвергают такой же обработке посредством экст акции,как упомянуто, используя каждый из водных растворителей, указанных в табл. 7. Каждый из экстрактов . собирают и затем концентрируют. Концентрированный раствор экстракта- на" сыщают сульфатом аммония и получают осадок. Полученный осадок снова растворяют в воде и подвергают обессоливанию посредством диализа, используя целлюлозную мембрану. Полученный таким образом раствор концентрируют до 5F по весу, затем добавляют сульфат аммония в количестве, соответствующем 25 от величины насыщения.

После удаления осадка, образовавшего" ся при упомянутой обработке„.к раст " вору снова добавляют сульфат аммония в количестве, соответствующем 403 . от величины насыщения. Полученный осадок растворяют в воде и подвергают ,такому we обессоливанию, как- упоминалось, затем пропускают через колон; ку с ДЭАЭ-целлюлозой. Адсорбированное

It на колонке вещество промывают водои, затем вымывают одномолярным солевым раствором. В элеат снова добавляют ,сульфат аммония в количестве 403 от величины насыщения и образовавшийся в результате осадок собирают и снова растворяют в воде. Полученный раствор обессоливают посредством диалиэа и концентрируют, затем высушивают распыливанием и получают посредством этого искомое вещество. Свойства полу-, ченного вещества и результаты его испытаний на живот ных приведены в табл. 7 .

Иетод щелочного экстрагирования с: ,,применением в качестве растворителя щелочи осуществляется так же, как описанный способ, эа исключением того, что вместо воды в повторной экст" ракции осадка применяют 1/10 H.. раст" вор едкого натра и после завершения экстракции доводят величину рН до нейтральной с помощью 1/10 н. соляной кислоты«.

В табл. 7 приводится инфракрасный спектр поглощения, измеренный по способу таблеток в бромистом калии, который графически изображен на фиг. 1 на котором видно поглощение 4 ОН при

2600-3200 см деформационные колеба" . ния - NH и -NH при 1600 и l530 см"". й. соответственно, широкэе поглощение

; при 1200-1000 см - антисимметричные валентные колебания С-О-С-связи пи13 961565 го, придает способность к иммунитету через хозяина и является эффективным для предотвращения ухудшения или резкого падения иммунитета или физической силы больных, которые прошли раЛ - личные курсы лечения, такие как химиотерапия, радиотерапия, хирургическая операция или переливание крови, независимо от того, были ли они поражены раком или нет. Более того, предлага-,10 емое вещество эффективно также для защиты больных от инфекционных болезней, таких как гепатит или пневмония, которые могут быть вызваны заражением вирусами или бактериями в ре- 15 эультате ослабления или упадка иммунитета или физической силы.

Кроме того, предлагаемое вещество при стоматическом введении больному не только способствует улучшению 2в общего физического состояния, но также действует как облегчающее работу кишечника и улучшающее аппетит больного. Предлагаемое вещество оказывается также очень полезным.для улучше- и ния функции кишечника больного, который длительное время лежит в постели.

Пример ы 1-4. Продуцентыкаждая линия СИ-101 (ГЕРИ-Р И 2412

СИ-102 (ГЕРИ-Р и 2413 и СИ-103 .Зв (ГЕРИ-Р И 2414, принадлежащих к .Coriolus чегэ1со1ог (Fr.) Quel засевается в 200-миллилитровую коническую колбу, содержащую 30 мл пита35 став, Ж: глюкоза 5, пептон 0,2, дрожжевой экстракт 0,3, КН РО 0,1 и HgS0 -7Н О 0,1. Культивирование ве31ут стационарно при 25-27ОС в течение 10 дней и мицелиальную пленку, 4а выросшую на поверхности питательной среды, гомогенизируют физиологическим раствором для получения посевного материала. Посевной материал затем вы-. севают в каждую из однолитровых колб 4 для выращивания, содержащих 200 мп: той.же самой питателвной среды, и инкубируют при 25-27 С в течение 25, дней, чтобы посредством этого получить грибницу. Мицелиальный выход со ставляет 4-4,3 r. на колбу для СИ-101, 2,0-2,5 г для СИ-102 и 2,7-3,2 г для

СИ-103.

Затем к каждой полученной грибницу (,100 r) добавляют 3 л дистиллиро" ванной воды и каждую иэ грибниц экстра- Я гируит при перемешивании при 98©С в течение 3 ч. После завершения экс-. тракции каждый раствор разделяют на

15 9615 ранозных колец в полисахаридной части и специфичное поглощение при

890 см, вызванное Р -связью глюкозы, но поглощение при 840 см " (а(-связь) едва заметно. 3

Так как большого различия в инфра- расных спектрах поглощения отдельных образцов не отмечается, в качестве типичного представителя даны результаты одного примера 1. 1о

Измерения ЯМР проводят, выбирая в качестве внутреннего эталона ДСС и .;применяя в качестве растворителя тяжелую воду. Данные, приведенные в табл. 7, представляют собой величины 1s

*осле коррекции в соответствии с допущением кривой Лоренца для устране" ния влияния остаточной легкой воды

Ь тяжелой воде.

Молекулярный вес предлагаемого ве- щ щества измеряют, применяя метод ультрацентрифугирования. Он равен 5000300000 для всех образцов. Для измерения используют седиментационное рав- новесие и искусственную граничную мо- у дель, применяя интерференционную оптическую систему. Условия эксперимента следующие: концентрация образца

0,34; растворитель 1/10 н. КС1; температура 25 С; длина столбика раство" jo ра 1,7 мм; скорость 22000 o6/мин;

Время измерения 5 ч.

Аминокислотный анализ выполняют в соответствии с обычным методом путем добавления 4 мл 6. н. соляной кислоты к 10 мг каждого образца, замораживая его в смеси сухого льда и ацетона, запаивания образца в трубке под

Уменьшенным давлением, гидролизуя его в течение 24 ч, при 110 С высушивая и затем растворяя в 30"40. мл лимоннокислого буферного раствора с величиной рН 2,20.

При определении удельного вращения сначала измеряют оптическое вращение cd"линией натрия (589 мм), используя

0,253-ный водный раствор каждого образца и 5-сантиметровые ячейки и вычисляют удельное вращение tg 1 из измеренного оптического вращения .

Измерение моносахаридного состава предлагаемого вещества проводят сле" . дующим образом. 3 мг каждого образца помещают в 5-миллиметровую стеклянную ампулу, в которую добавляют 10 мл

34""ного раствора хлористого водорода 55 в метаноле, и проводят метанолиз при

100 С в течение 16 ч. Образовавшийся продукт нейтрализуют углекислым серебром и отфильтровывают при комнатной температуре. Фильтрат упаривают досуха и затем растворяют в 0,5 мл

cyxoro пиридина.

8.полученный раствор добавляют

0,2 мп гексаметилдисилазана и 0,3 мл триметилхлорсилана и смесь оставляют стоять в течение 30 мин при комнатной температуре, чтобы осуществить введение триметилсилильных групп. По завершении этого процесса смесь раст! воряют в хлороформе и, после удаления избытка реагента промыванием во- дой, полученный раствор упаривают досуха. Обработанное таким образом вещество (триметилсилат ) растворяют в четыреххлористом углероде и оценивают посредством газовой хроматографии.

Тип связи сахаридов определяют в соответствии со способом Хеуорса, Т.е.

2 г каждого образца растворяют в 10 мл

1 н. раствора Na0H и, поддерживая тем- пературу смеси 40-50 С в токе азота, при интенсивном перемешивании добавляют по каплям 20 мл диметилсерной кислоты и 40 мй 30 -ного раствора гидро окиси натрия в течение нескольких часов. После отстаивания смеси в течение ночи ее подвергают такой же обработке тем же самым количеством метилирующего реагента. После нейтрали" зации реакционный раствор диализуют в протекающей воде, диалиэат концентрируют при уменьшенном давлении и подвергают трехкратному метилированию.

После дополнительной нейтрализации и диализа смесь упаривают досуха при уменьшенном давлении. Оставшееся вещество растворяют в 20 мл смеси хлороформа с метанолом (10:1) и к раствору добавляют смесь петролейного эфира и эфира (1:1) для осаждения метилированного вещества. Затем 20 мг этого метилированного вещества подвергают гидролизу с 1 н. серной кислотой при 1000С в течение 16 ч и продукт гидролиза обычным способом переводят в альдитолацетат, молярное соотношение определяют по площадям пиков на газовой хроматограмме. Для того, чтобы различить 2,3,6-три-О-Ме-9 и 2,3,4-три-О-Ме-6-, 20 .мг метилированного вещества подвергают метанолизу при 100 С в течение 16 ч в запаянной трубке, применяя 33-ный раствор хлористого водорода в метаноле. При сутствие 2,3,4-три-О-Me-G- в продук17, 961 56 re метанолиза не подтверждается газо"- э хроматографическим анализом. Каждый з из упомянутых продуктов разложения Q идентифицируют по газовой хроматогра- э мме, используя эталон. Кроме того, i s p каждый из упомянутых продуктов раз- с ложения выделяют, применяя жидкостную г хроматографию на колонке и/или крис-, П таллизуют или переводят в кристалли- т ческое производное. I0 н

Свойства, структурные характерис- и тики и противоопухолевая.активность полученных таким образЬм веществполисахаридов, связанных с белками, показаны в табл. 7. 1э в

fl ри ме ры 5и 6. Проводят . в налогично примерам 1-4 с использова" в . иием штамма грибков ГЕРМ-Р У 2711, r . Coriolus hirsutus (Fr.) Quel. При .. р этом получают практически те.же самые 2в и результаты, что и в ходе проведения и а

Оюю ВююФююю

Опухоль

Дозировка

Способ получения продукта р ° ю Ф»

Предла :Известгаемый,ный ! аю оюююю юю

Раковое 1000х10 95 .новооб" раэование 500xl0 85

Эрлиха

Саркома-180 1000х10 85-90 60-65

500х10 83-89 50"55 4 - дозировка,мг/кг в день, умноженная на число назначений.

Таблица 2 (Результаты

Пурпурный Сахариды

Реакция с< -нафтолом и серной кислотой

Коричневый

Реакция с индолом и серной кислотой

Зеленоватоголубой

Реакция с антроном и серной кислотой. Коричневый

Реакция с фенолом и серной кислотой

Цветная реакция Цвет

5 18 ксперимента примера 1, когда исполь уют грибки Cor i ol us versicolor (Fr )

uei (штамма ГЕРМ-P Ю 241?). Другие ксперименты проводят аналогично вайанту способа, описанному в примере 1, использованием штамма ГЕРИ-P II 2712 рибков Corioius pargamenus (Fr.) Pat. ри этом также достигают лрактически е же результаты, что и;в ходе проведе- ия эксперимента примера 1. Свойства олучаемых веществ приведены в табл.5.

Получаемые вещества имеют структур у, в которой белок связан с полисааридной частью. Предлагаемое вещест о не имеет запаха, безвкусно и раст оримо в воде, имеет светло-коричнеую или коричневую окраску. Кроме то о, предлагаемое вещество не имеет ohеделенной точки плавления и постеенно чернеет и разлагается при тем" ,ературе выше 120©С. б,л и ц а 1

961565

Продолжение табл. 2

r Результаты е»

Цветная реакция

Цвет е е

Реакция с триптофаном и серной кислотой

Пурпурно- . коричневый

Способ Лоури"фолина

Голубой

<" Аминокислоты

Реакция с нингидридом после гидролиза соляной кислотой (6 н. НС1, l10C, 20 ч фиолетово" голубой

Таблица 3

Г е»

Условия

Содержание. влаги, Ф, через,ч

983

20 С

12,5 16,0 22,5 25,5 27,0 27,0 27,0

10,0

9,0 9 5 11,7 15,0 15,5 16,0 16,6 17,0

25ОС

523

20 С

9,0 9 5 1 1 .7 15,0 15,3 15,5 1 5,7 16, 0

8,5 9,0 Я,О 12,5 12,512,512,5

323

4еС

8,0

Таблица 4 е

Продукты гидролиза метилированных" сахаридов

Связь

Иолярное соотношение

Ь» е »еее ее» е» е

2,3,4,6-Тетра-О-ме-, ."...", тил-С . 6

2,3,6уТри"О-метил-С

2,3-Ди-О-метил-С -"к Я

0,5-3

2,6-Ди-О-метил-С вЂ” Q вЂ” в

2,4-Ди-О-метил-С

2,4,6-Три-О-метил-С

Относительная влажность

Температура

Относительная влажность

Температура

Относительная влажность

Температура

Относительная влажность

Температура

Пептидные связи, тиро" зин, триптофан, цистеин

3 12

0,1-2г5

2 или менее

961565

Таблица 5.

«««««

Вид жиВОтнОГО д(З мг/кг

Путь введения

Самки Самцы 1300

>5000

Мыши

Стоматически 720000

T 20000

Внутривенно 7600". 600

>5000

35000

Крысы г 5000

>20000

>5000

) 20000

Таблица

КоэФфициент подавления опухоли, ф

» «

Способ пересадки и введения Ф

Раса )евши или крысы

Число клеток, пересаженных животному

Доза, мг/кг в день х кратность введения

",0пухоль

24 . 500 х 10 32

24 . 250 х 10 32

24 - l000 х 10 32

Саркома-180 1Сй" I CL ЗС- IP

10ь

SC-1Р (теердыд тип) !

SC.-. РО. 10

SC-PO lO

83-89

24, 500. х 10 32. SC - IР.

1Cl1-ICt. SC - ll

10 ..

24: 10,х 11 32

24. 50 х 10 35

97-100

100

7 дн. 250 л 10 60

0авгоп i. 1Р - 1Р

Асцитическая, гепатомв AII-13

Более 70а животных

°ылечи вается и выживает

Л р и м е ч а и и е. SC подкожна1. IP внутрибрюаинно; PO - анутрибрееинно и стоматически

«««« » »»» (Раковое но вообравование

Эрлиха 1твер. дый тив) Внутривенно 11300

Подкожно >5000

Внутрибрюшинно f5000

Подкожно

Внутрибрвшинно

Стоматически

Время до начала введения после пересадки,ч

Время, необходимое для овен ки де»» стеня, дни после пересадки

97-100

85-90

961565

Табли ц а 7

Пример

Показатели (.

° еЕ е ю ° Фе ее е атее

1 2 ев ее ее ее е ее е » е » в « ею ее ее ее е

3 а

2412 . 2412

2413 2414

СМ-101

СМ-102

Горячая вода

Выход, г, на 100 г су" 0,7 хих грибов

019

Молекулярный вес (х 10 ) 0,8-25

1 10-19 0,8-29

4,7 8,9

0 5-28

Средний молекулярный вес (х 104) 6,8

9,0

Пурпурный Пурпурный

Реакция с с(,"нафтолом и серной кислотой

Коричневый Коричневый Коричне- Коричневый вый

Реакция с индолои и серной кислотой,Зеленоватоголубой

Зеленоватоголубой

Реакция с антроном и серной кислотой

Зеленова- Зеленовато.то" голу" голубой бой

Коричневый

Реакция с Фенолом и серной кислотой

Коричневый

Реакция с триптофаном Пурпурно- Пурпурнои серной кислотой, коричневый коричневый

Пурпурно- Пурпурно" коричне- коричневый вый

Способ Лоури-Фолина - Голубой Голубой

Голубой Голубой

Фиолетово-Фиолетовоголубой голубой

Фиолетово- Фиолетовоголубой голубой

3600-3200

Присутст- Присутст- Присутст- Присутст" вует вует вует вует

ll II 11

1600

ГЕРМ-Р, Й

Линия, М

Способ экстрагирования

Цветная реакция (сахарид) Цветная реакция (белок) Реакция с нингидрином после гидролиза с соляной кислотой (6 н.

НС1, 20 ч) И удельное вращением ) 4

ИК-спектры поглощения1см

СИ-101

Щелочь

СИ-103

Щелочь

961565

Процолжение табл. 7 25

Пример

Показатели а аааS аа а юаааааааа

Il II

II - 1!

1530

1200-1000

II I I

890

II 11

840

ЯИР-спектры

Область поглощения, МеДе

Присутст- Присутст" вует вует

0,940,1

Присутствует

Способ получения мукополисахаридов

Патент 961565