Способ одновременной очистки протеолитического фермента и его обратимого ингибитора

Способ одновременной очистки протеолитического фермента и его обратимого ингибитора

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

СдФрЗ СовЕтскив Сацииалистическик

Республик

<111 962302 (61) ???????????????????????????? ?? ??????. ????????-?????? (22) ???????????????? 10. 79 (21) 28276 29>

Р М g> з

С 12 N 9/50/ G 01 N 33/50 с присоединением заявки ¹(23) Приоритет,Государствеииый комитет

СССР ио делам изобретеиий и открытий (53) УДК 577.15.07 (088.8) Опубликовано 300982. Бюллетень №36

Дата опубликования описания 30 ° 09.82 (72) Авторы изобретения

В.A. Березин и A.Ä. Рева

®СЕСОЮЗИА Я

13 " " пхиимстм (3

:ИВаав

Днепропетровский ордена Трудового Красного государственный университет им. 300-летия ук анны с Россией (71) Заявитель (54) СПОСОБ ОДНОВРЕМЕННОЙ ОЧИСТКИ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКОГО

ФЕРМЕНТА И ЕГО ОБРАТИМОГО ИНГИВИТОРА

Изобретение относится к биохимии, а именно к способу одновременной очистки протеолитического фермента и его обратимого ингибитора.

Известны способы очистки карбок- 5, сильных протеолитических ферментов аффинной хроматографией с использованием различных биоспецифических сорбентов: гемоглобинагарозы (1), пепстатинсефароэы (2) и др с испольэо- 10 ванием в качестве элюентов различных буферных снстем. Используеьые при аффинной хроматографии биоспецифические.сорбенты содержат в качестве лигандов соединения, обладающие биоспецифическим сродством к очищаемому ферменту. Аналогичным путем могут быть очищены и ингибиторы.

Общим недостатком данных способов является получение на выходе только р одного очищенного продукта протеолитического фермента, либо ингибитора, а также недостаточйая специфичность второго этапа аффинной хроматографии - стадии элюции сорбированного фермента или ингйбитора буферным раствором.

СПособ одновременной очистки протеолитического фермента и.его обратимого ингибитора путем аффинной хро« матографии в литературе не описан.

Цель изобретения — более полное использование сырьевых источников растительного, животного либо микробного происхождения и разработка нового способа одновременной очистки препаратов протеолитического фермента и его обратимого ингибитора.

Указанная цель достигается тем, что аффинную хроматографию фермента осуществляют путем сорбции ферментного раствора на биоспецифическом сорбенте на основе полиакриламидного или агароэного геля, содержащем в качестве лиганда субстрат или ингибитор данного фермента, при 0 — 4 С и рН соответствующем рй-оптимуму фермента, в присутствии 0,02-0,1 М буфера, содержащего 0,2-1 М NaCl u элюции Фермента раствором обратимого ингибитора, предварительно освобожденного от сопутствующих белковых примесей гельфильтрацией через колонну с сефадексом в условиях вышеуказанной буферной системы, с последующей гельфильтрацией элюированного фермент-ингибиторного комплекса через колонну с сефадексом в тех же условиях для отделения низкомолекулярных примесей и разделением очищен-. ного фермент-ингибиторного комплекса аовторной гель-фильтрацией при рН, 962302 на 3-5 единиц отличающемся от значения рН-оптимума фермента.

В 1.ачестве фермента используют, например, катепсин D из мозга быка или трипсин. Соответственно в качестве обратимого ингибитора обычно используют ингибитор катепсина Р из картофеля и ингибитор трипсина из люцерны, в качестве биоспецифического сорбента — соответственно сорбент на основе полиакриламидного геля, (О. содержащий в качестве лиганда гемог-. лобин, либо сорбент на основе агарозного геля, содержащий в качестве лиганда ингибитор трипсина из люцерны. При этом обычно сорбцию и элюцию ($ катепсина D проводят при рН 4,0, а трипсина — при рН 5,0, разделение фермент-ингибиторного комплекса осуществляют в первом случае при рН 8,6, во втором — при рН 2,0. 2О

Предлагаемый. способ. разработан для очистки протеолитического фермента и его ингибитора, обладающего обратимым характером связывания с фермен-, том и молекулярным весом в 1,5-10 раз меньшим молекулярного веса фермента.

Именно эти два фактора лежат в основе технологии предлагаемого способа.

Сущность способа заключается в том, что для .получения очищенных пре" паратов протеолитического фермента и его ингибитора за обычным этапом биоспецифической сорбции протеолитического фермента на сорбенте применяют этап биоспецифической (аффин- 35 ной) элюции фермента частично очищенным препаратом обратимого ингибитора, предварительно освобожденного гель-хроматографией от высокомолеку лярных примесей, т.е ° обладающих 4p молекулярным весом, превышающим молекулярный вес ингибитора). Полученный фермент-ингибиторный комплекс отделяется от сопутствующих низкомолекулярных примесей гель-фильтрацией 45 и легко разделяется на очищенный пре парат протеолитического фермента и очищенный препарат ингибитора.

Способ позволяет получать очищенные препараты пртеолитического фермента и его ингибитора с высокой. степенью очистки (степень очистки фермента (3)-(продажный препарат) 80, ингибитора — 30-60).

Пример 1. Одновременная очистка катепсина D из мозга быка и ингибитора катепсина Р из картофеля.

Катепсин Р из животных тканей . имеет молекулярную массу 43000 даль» тон, а поливалентный ингибитср катепсина Р и трипсина из картофеля — 60

27000, т.е. в 1,6 раза меньше.

В качестве аффинного сорбента используют гемоглобин, иммобилизован ный на биогеле Р-300. Сорбент синтезируют по известной методике, активируя биогель глутаровым альдеги, дом (4).

Препарат катепсин D из мозга быка перед аффинной хроматографией готовят по методу (5).

Осуществляют сорбцию катепсина .Р из экстрактов мозга при 0-4 С на вышеуказанном сорбенте в присутствии

0,1 М ацетатного буфера и 1 М NaCI (рН 4,0 -,это значение рН близко к оптимальному)..Балластнье белки удаляют промыванием сорбента тем же буфером.

Ингибитор получают известным способом — экстракцией из клубней картофеля и фракционированием сульфатом аммония (6).

Раствор неочищенного ингибитора, полученный как указано. выше, пропускают через колонку с сефадексом 6-100, уравновешенную 0,1 М ацетатным буфером с 1 M NaCI(pH 4,0) для удаления белковых примесей с большим молекулярным весом, чем ингибитор. Элюцию катепсина D осуществляют раствором ингибитора катепсина D из картофеля при тех же случаях, что и сорбцию.

Условия элюции фермент-ингибиторНого комплекса таковы (рН 4,0), что полученный комплекс катепсина D H его ингибитора из картофеля находится в ассоциированном состоянии и молекулярный вес его равен сумме молекулярных весов фермента и ингибитора, Раствор, содержащий комплекс, отдедяют от низкомолекулярных белковых примесей, пропуская его через колонку с.сефадексом 6-100, уравновешенную

0,1 М ацетатным буфером с 1М NaCI (рН 4,0).Для того, чтобы разделить очищенные фермент и ингибитор проводят.повторную гель-хроматографию комплекса на колонке с сефадексом 6-100, но в условиях, способствующих его диссоциации (колонку уравновешивают

0,1 М бикарбонатным буфером с 1 М

NaC1 при рН 8,6) .

Степень очистки катепсина Р— 80, его ингибитора — 60 по сравнению с исходными препаратами.

Пример 2 . Одновременная очистка продажного препарата свиного трипсина (Реахим, Олайнэ) и его низ-комолекулярного инигибйтора из люцерны.

Свиной трипсин имеет молекулярный вес 24000 а ингибитор трипсина из люцерны 7000. Отношение их молекулярных весов равно 3,4.

В качестве аффинного сорбента используют очищенный ингибитор трипсина из люцерны, иммобилизованный на

BrCN-активированной сефарозе 4 В.

Исходный препарат трипсина является продажным (Реахим™, Олайнэ).

Препарат ингибитора трипсина иэ люцерны для элюции фермента получа962302

Формула изобретения.Филиал ППП "Патент", г.Ужгород, ул.Проектная,4 ют экстракцией сухих листьев и стеблей 2%-ной трихлоруксусной кислотой обрабатывают (NH4$ S04 до 703 насыщения и диализуют против раствора

0,1 М ацетатного буфера, содержащего 0,22 M NaC1 (pH 5,0),, и пропускают через колонку с сефадексом 6-100, уравновешенную вышеуказанным буфером, удаляя балластные белки с молекулярным весом большим, чем молекулярный вес ингибитора.

Сорбцию трипсина проводят при

0-4 С в присутствии 0,1 М ацетатного буфера с 0,22 N NaC1 (рН 5,0).

При рН 5,0 образуется достаточна прочный комплекс трипсина и его природных)5 ингибиторов. Балластные белки, находящиеся в препарате трипсина, удаляют промыванием сорбента тем же буфером.

Элюцию трипсина осуществляют препаратом ингибитора трипсина из люцер-ур ны, полученным, как указано выше.

Полученный комплекс из растворимых фермента и ингибитора отделяют от низкомолекулярных белков и пептидов, пропуская через колонку с сефадексом G-100, при тех же условиях.

Разделение трипсина и ингибитора осуществляют, проводя повторную гельхроматографию на колонке с сефадексом G-100, но в условиях, способствующих диссоциации комплекса (колонкуЗО уРйвновешивают 0,01 н НС1, с 1 N МаС1, 15% изопропиловым спиртом (по объему), рН 2,0. .Технико-экономический эффект от использования данного способа заключается в сокращении затрат време- 35 ни и сырья при одновременной очистке протеолитического фермента и его ингибитора по сравнению с раздельным производством этих препаратов из источников сырья животного, раститель- 40 . ного или микробного происхождения.

1. Способ одновременной очистки протеолитического фермента и его обратимого ингибитора, о т л и ч а.юшийся тем, что осуществляют аффинную хроматографию фермента путем сорбции ферментного раствора на биоспецифическом сорбенте на основе полиакриламидного или агарозного геля, содержащем в качестве лиганда субстрат или ингибитор данного фермента, при 0-4 С и рН, соответствующем рН-оп55 тимуму фермента, в присутствии 0,020,1 М буфера, содержащего 0,2-1 М

NaCI, и элюции фермента раствором обратимого ингибитора, предварительно освобожденного от сопутствующих бел- 60 ковых примесей гель-фильтрацией через колонку с сефадексом в условиях

;ВНИИПИ Заказ 7428/37 указанной буферной системы, с последующей гель-фильтрацией элюированного фермент-ингибиторного комплекса через колонку с сефацексом в тех же условиях для отделени я низ комолекулярных примесей и разделением очищенного фермент-ин гибит орно го компле кса повторной гель-фильтрацией при рН,. на +3 — 5 единиц отличающемся от значения рН-оптимума фермента.

2. Способ по и. 1, о т л и ч а юшийся тем, что в качестве фермента используют катепсин D из мозга быка, в качестве его ингибитора — ингибитор катепсина D из картофеля, в качестве биоспецифического сорбента используют сорбент на основе полиакриламидного геля, содержащий в качестве лиганда гемоглобин, сорбцию и элюцию катепсина D проводят при рН

4,0, а разделение фермент-.ингибитор ного комплекса проводят при рН 8,6.

3. Способ по и. 1, отличаюшийся тем, что в качестве фермента используют трипсин, в качестве его ингибитора — ийгибитор трипсина из, люцерны, в качестве биоспецифического сорбента используют сорбент на основе агарозного геля, содержащий в качестве лиганда ингибитор трипсина из люцерны, сорбцию и элюцию трипсина проводят при рН 5,0, а разделение фермент-ингибиторного комплекса проводят при рН 2,0.

Взяточники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Smith R., Turh V. Cathepsin D:

КарЫ Isolation by Affinity Chromatography on Haemog1obin Agarose Resin, Bur. ó.. Biochem 1974, 48, 245-254.

2. Казакова О.В., Орехович В.Н.

Выделение катепсинов группы D с помощью хроматографии по сродству. Биохимия, 1975, т. 40, вып. 5, 969-972.

3. Суровцев В.И. Водонерастворимые производные ферменты. Успехи современной биологии, 1974, т. 77, вып. 1, 129.

4 . Комиссаренко С.В., ABpaMeac С.

Свойства имчуносорбентов, приготовленных путем связывания антигенов,: с активированным глутаровым альдегидом,полиакриламидным гелем, BrCN-активированной агарозой и сополимеризации автогенов глутаровым альдегидом. Украинский биохимический журнал, 1978, т. 50, Р 4, 500-511 °

5. Березин В.A. Рева A Ä. и др.

Выделение и очистка катепсина D из коры головного мозга быка и свиньи. Биохимия . 1979, т. 44, нып. б, 10 30- 10 35.

6. Acta bio1.med. germ ; 1977, т. 36, В 11 1873.

Тираж 505 Подписное