Способ получения сорбента для афинной хроматографии на основе сефарозы

Способ получения сорбента для афинной хроматографии на основе сефарозы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

А.Л. Терентьев, И.Е. Малахов, С.К. Кривоносо

С,П. Фещенко, A.K. Тагирова и Е.Г. Соломко (72) Авторы изобретеиия

2»й Иосковский ордена Ленина государственн институт им. Н.И. Пирогова (7l ) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СОРБЕНТА ДЛЯ АФИННОЙ

ХРОИАТОГРАФИИ НА ОСНОВЕ СЕФАРОЗЫ 2

О ONa

1:

Изобретение относится к биологической химии, в частности к препаративной и .технологической биохимии белI ков, и может быть использовано для получения и фракционирования ферментов из различных биологических объек4. где R1= Н или S0 0Na

Ry= ЬО ОИа или Н при нагревании в присутствии карбоната и хлорида натрия (1 ).

В этом способе взаимодействие цибакрона синего r., сеоарозой (сефадектов, а также сывороточных белков человека и животных.

Известен способ получения сорбента для афинной хроматографии на основе сефарозы взаимодействием сефарозы с веществом формулы сом ) осуществлялось в следующих услого виях: к 350 мл суспензии сефадекса, содержащей 10 г сефадекса, добавляли при 60 С капельным методом 60 мл раствора, содержащего 2 r цибакрон синего красителя. Перемешав 30 мин, до v

40 4 так и внутри гранул. В то же время, краситель, оказавшийся связанным с полимером внутри гранул, является гораздо менее доступным для белков. и ферментов из-за стерических. помех, оказываемых на белки полимерными це" пями гранул, что снижает емкость сорбента.

9680

So2oiva и

NH

20А О где Я. = Н или 5020Ма;

Р = 0 Ойа или Н, при нагревайии в присутствии карбоната и хлорида натрия к 100 вес.ч. ефарозы добавляют 1,8-2,2 вес.ч. ук занного вещества, 10 вес.ч. хлорида натрия, 2 вес.ч. карбоната натрия, указанные компоненты перемешивают и 35 подвергают тепловой обработке при

55 С в течение 10 ч.

Вещество указанной выше формулы называется цибакрон синий краситель.

Способ осуществляется следующим об-40 разом.

К гелю сефарозы добавляют сухой хлористый натрий, цибакрон синий краситель в порошке, смесь тщательно перемешивают, добавляют сухой карбонат натрия, еще раз перемешивают и поме; щают в суховоздушный термостат при

55ОC на 10 ч. Полученный сорбент тщательно отмывают дистиллированной водой. 50

Пример 1. К 100 вес,ч. сефарозы 6 В добавляют 10 г сухого хлористого натрия, 2 r порошка цибакрон синего красителя, смесь тщательно перемешивают, добавляют 2 г сухого кар- ЗЗ боната натрия, еще раз перемешивают и ставят в суховоздушный термостат при 5 С на 10 ч. Полученный сорбент, l — 4

3 .бавляли 45.г хлористого натрия и перемешивали еще 1 ч, после чего смесь нагревали .до 80 С добавляли 4 г карбоната натрия и. держали в течение 2 ч при 80 С при перемешивании. После это-

ro смесь охлаждали при комнатной температуре и отмывали до обесцвечивания промывных вод. Следует заметить, что температурный режим, соблюдаемый при этом способе (80 С ),может выдер- 10 жать сефадекс и марки сейарозы СЙ (поперечно-сшитой ), обычная сефароза при такой температуре расплавляется, Кроме того, обрабатывая красителем, предварительно растворенным, получают 1 равномерное распределение красителя по гранулам геля как на поверхности, Целью изобретения является,.упрощение способа,,удешевление продукта и повышение емкости сорбента.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения сорбента для афинной хроматографии на осно ве сефарозы взаимодействием сефарозы с веществом фориулы тщательно отмывают дистиллированной водой. Полученный сорбент способен в экспериментах по афинной хроматографии связать около 20 мг сывороточного альбумина человека и крысы.

Пример 2. К 100 вес.ч..сефарозы 4В добавляют 10 г сухого хлорида натрия, 2 r порошка цибакрон синего красителя, смесь тщательно перемешивают, добавляют 2 г карбоната натрия, еще раз тцательно перемешивают и ставят в суховоздушный термостат при тех же условиях (повышать температуру нагревания не рекомендуется, так как это отразится на фильтрующих свойствах полученного сорбента ). 1 мл полученного сорбента способен связать до 15 мг сывороточного альбумина человека или крысы.

Пример 3. К 100 вес,ч. сефарозы бВ при тех же условиях добавляют 2,2 г сухого порошка цибакрон синего красителя, условия коньюгации аналогичны приведенным в примере 1.

Емкость сорбента: на 1 мл геля можно выделить не более 20 мг альбумина.

Пример 4. К 100 вес.ч. сефарозы 4В при тех ие условиях добавляют 1,8 r сухого порошка цибакрон синего красителя, условия коньюгации аналогичны приведенным в примере ?.

5 9680 .Емкость полученного сорбента: на 1 мл сорбента можно выделить за один раз

12 мг сывороточного альбумина. 1аким образом, полученный сорбент обладает большой емкостью (от 12 до

20 мг альбумина на 1 мл сорбента ), в то время. как фирменный сорбент "голубая сефароэа" в .этих we условиях связывал около 10 мг альбумина на.

1 мл. Учитывая, что при применении подобного типа сорбентов, работа проводится в относительно мягких условиях: рН от 4 до 9, элюирующая способность буфера регулируется путем добавления.хлористого натрия до 1-2 моль1

/л, температура от ООС до 40ОС, т.е. тех условиях., при которых белки не денатурируются, для синтеза сорбента вполне подходят сефарозы обычных марок, которые намного дешевле попе- ; В речно-сшитых сефароз. Добавление к сефарозе красителя и .других ингредиентов в виде порошка способствует основному распределению красителя на поверхности гранул сефарозы, чем обусловлено увеличение емкости нашего сор- бента по сравнению с Ъирменным". Кро40 6 ме того, температурные условия синтеза сорбента по предложенному способу не нарушают структуру геля и фильтрационные и механические свойства полученного нами сорбента не хуже чем у необработанной сефарозы или коммерческих образцов "голубой сефарозы". Сто имость полученной по предложенному способу "цибакрон синей сефарозы" с учетом стоимости потраченных на ее производство реактивов и рабочего времени, примерно в 20-40 раз дешевле коммерческой "голубой сефарозйн.

Таким образом, предложенный способ по сравнению с известным спосо" .бом и базовым объектом позволяет упростить получение сорбента, повысить

его емкость и снизить стоимость про1 дукта. формула изобретения

R(2

502090

Н2И о оаа

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе, 1. Вопле Н.3. и др. ЛНiuity chro.matography of рЬоярпо госйо1:inase

using Cihacron Ыц ЕЗВ-A. "Journal

of Chronatography",- 1972, т. 69,,с. 209 (прототип).

Составитель И. Стояченко

Редактор Г. Волкова Техред Ж Каателевич Корректор С. Шекмар

Заказ 8026/38 Тираж 514 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

1 Ц0)5 Москва ><-)5 Раушская наб. 8. 4/g

Филиал ППП "Патент", г, Ужгород, ул. Проектная, Ф где R< = Н или S0 0Na;

R2 = S020Na или Н; 4ю при цагревании в присутствии карбоната и хлорида натрия, î т л и ч à юшийся тем, что, с целью упрощения способа, удешевления продукта и повышения емкости сорбента, к 100 вес.ч. сеоарозы добавляют 1,82,2 вес,ч. укаэанного вещества, 10 вес.ч. хлорида натрия, 2 вес.ч. карбоната натрия, указанные компонен"

Способ получения сорбента для афинной хроматографии на основе сефарозы взаимодействием сефароэы с веществом формулы

I ты перемешивают и подвергают тепловой.обработке при 55ОС в течение 10 ч.