Способ стабилизации декстраназы реniсilliuм funiсulоsuм

Способ стабилизации декстраназы реniсilliuм funiсulоsuм

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

ОП ИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Союз Советских

Социалистических

Республик (»)968069 (61) Дополнительное к авт. свид-ву— (22) Заявлено 24.04.81 (21) 3306503/28-13 с присоединением заявки №вЂ” (23) Приоритет— (51) М.К .

С 12 N 9/46

С 12 N 9/96

Гееударственнмв камитет

СССР пе аелвм нзвбретеник и етврмтий

Опубликовано 23.10.82. Бюллетень № 39

Дата опубликования описания 28.10.82 (53) УДК 577.15..07 (088.8) (72) Авторы изобретения

В. И. Максимов, Е. И. Беленькая, Н. Н. Сазонова и

Всесоюзный научно-исследовательский биотехниче (71) Заявитель (54) СПОСОБ СТАБИЛИЗАЦИИ ДЕКСТРАНАЗЫ

PEN ICILLIUM FUN ICULOSUM

Изобретение относится к микробиологической промышленности и может быть использовано в медицине при получении препаратов декстраназы.

Декстраназы применяются в стоматологии для профилактики кариеса зубов, для получения клинического декстрана путем частичного гидролиза высокомолекулярного декстрана, а также для изучения структуры полисахаридов, содержащих в своем составе «-1,6 гликозидные связи.

Известны способы стабилизации декстраназы, входящей в состав зубной пасты, зубных порошков, путем внесения стабилизирующих добавок, например желатины и пептона в количестве 0,3 — 3%. Добавление этих стабилизаторов сохраняло активность фермента на 80 — 89% в течение 3 мес хранения при температуре 30 С (1).

Известен также способ стабилизации декстраназы путем добавления стабилизаторов-активаторов декстраназы в виде солей МдС1г, которые вносят в пасты в количестве 0,1 — 0,3%. При этом фермент сохраняет свою активность на 86% в течение

9 мес. Добавление солей МпС1 и СаС1 активирует фермент в 5 — 14 раз. Таким об2 разом, ионы Мп+, Са++ и Mg+ стабилизируют и активируют декстраназу в составе зубных паст (2).

Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому является способ стабилизации декстраназы Penicillium funiculosum, основанный на использовании стабилизирующих добавок путем сорбции фермента на бентоните при рН 3,5 — 4,5 с последующей промывкой и элюцией фермента с сорбента при рН 8,0 — 8,2 0,1%-ным раствором стабилизатора, в качестве которого используют полиглюкин или продукт его гидролиза, глюкозу, мальтозу, лактозу, маннит или сульфат аммония. Полученный элюат лиофилизируют в присутствии стабилизатора (при

15 концентрации последнего 0,2%) .

Бентонит обычно используют в количестве 2 — 3%.

В качестве исходного ферментного раствора обычно используют ферментный конго центрат, полученный осаждением фермента сульфатом аммония (70%) из культуральной жидкости Реп. funiculosum с последующим перерастворением осадка в воде (2).

Недостатком известного способа является то, что препарат очищенной декстраназы, 968069

3 полученный после десорбции ее с глины и лиофилиэации в присутствии углеводов, добавляемых в известном способе для сохранения активности при лиофилиэации, оказывается недостаточно стабильным при длительном хранении. При хранении такого препарата в течение 12 мес наблюдается потеря активности на 30 — 50%.

Целью изобретения является удлинение сроков хранения декстраназы без потери активности.

Указанная цель достигается тем, что согласно способу стабилизации декстраназы

Pen. funiculosum; который предусматривает сорбцию фермента на бентоните при рН 3,54,5, отличительным признаком которого является то, что полученный сорбат обрабатывают 10 — 25 /р-ным раствором этанола в воде.

Бентонит обычно используют в количестве 2 — Зо/о.

Способ осуществляется следующим образом.

Раствор .декстраназы, например в воде, полученный из культуральной жидкости Реп.

funiculosum после концентрирования и осаждения сульфатом аммония и растворения осадка в воде, обрабатывают бентонитовой глиной в количестве 2 — Зо/о. Глину с адсорбированной на ней декстраназой отделяют от раствора и промывают водным раствором этанола, концентрация которого составляет от 10 до 25О/о. Глину с ферментом отделяют от избытка водного спирта и помещают на хранение в герметически закрытую тару. Измерение сухого остатка, проведенное методом доведения до постоянного веса, показало, что он составляет 40 — 50 /р от веса влажного материала, заложенного на хранение.

Фермент сохранял полную активность только при хранении его в адсорбированном состоянии в присутствии влаги в герметически закрытой таре. Определение количества влаги показало, что оно составляет 50 — 60О/р.

Установлено, что длительность хранения существенным образом зависит от стабилизирующих добавок. Всего испытано 14 составов смесей (таблица), указанных в примерах, и найдено, что добавки этанола наилучшим образом влияют на стабильность декстраназы при хранении. Одинаково положительные результаты получены для концентраций этанола 10 и 25О/0. Срок хранения фермента в сорбированном состоянии составил 1 год без потери его активности.

Примеры 1 — 14. К 260 мл раствора декстраназы Реп. funiculosum с активностью

136 ед/мл добавляют 7,8 г (Зо/o) глины «Аскангель», устанавливают рН вЂ” 4,0 добавлением нескольких капель 50О/0-ной уксусной кислоты. Смесь перемешивают 2 ч. Глину отделяют от раствора центрифугированием, супернатант содержит 22,4 /р активности, не адсорбированной на глине. Глину с оставшимся на ней ферментом (77,6 /р от исходной активности) промывают водным раствором разных веществ названия и концентрации веществ приведены в таблице). Промывание осуществляют следующим, образом. К одному грамму влажной глины прибавляют

10 мл водного раствора стабилизирующей добавки рН 4,5, перемешивают 1 мин, смесь центрифугируют в течение 5 мин при

6000 об/мин, сунернатант отбрасывают, а влажную глину с ферментом помешают в полиэтиленовую пробирку, плотно закрывают резиновой пробкой для герметизации.

Через 12 мес.хранения во всех пробах был определен сухой вес глины с адсорбированной на ней декстраназой и определена активность фермента в пересчете на сухую глину. Данные приведены в таблице.

Для сравнения был приготовлен препарат по известному способу и оставлен на хране30 ние. Активность в этом препарате через

12 мес хранения составляла 60 /о от исходной.

Из таблицы видно, что в составах, где в качестве стабилизатора присутствует этиловый спирт в количестве 10 и 25О/р (пример

1, 2, 4 и 8) активность фермента сохраняется значительно лучше, чем в смесях, где стабилизаторы используются без добавления спирта (пример 5, б, 9 и 10). При обработке глины с адсорбированным на ней фермендп том 10 и 25О/о-ным этанолом активность декстраназы сохраняется . полностью в течение 12 мес хранения.

Технико-экономическая эффективность предлагаемого способа заключается в том, что он позволяет повысить сроки хранения

45 без потери активности от 6 до 12 мес.

968069

1 а

1 IU

1 3 о!

1 Щ

1 1и

I

1

1

1

I

I

I

I

I

I

1

1

1

1

1

1

1

1

1

Iи о

ФьЬ

1Y

>3 Ъ м

Ю

О СС>

LC> м

1 3> ! 1и о

1 Ф

1 S

1 !

Ч3 м!

С3

CD сч!

Г\ м

;о

CD

О \

1 !

1

Э 1

Щ 1

a I х

I

CL 1 с

2 1

m 1

lU 1 х

fU 1

CL 1

3и м

Э 1

С

JI I

1iu о

Ф I

I- 1 м

lU 1

1 а

Щ

z г

О I

1 I

Щ 1

3и

Ю 1

1

>О сч

7 м

Ю! и

Э 1 Iи о сч

1 Ф

1 S

1 I1

1 Ct

Ф

1 Iи о

1 Z

1 %

1 Щ с

I CCl сч сч

-З с>

-! о м

-С м

СО

СГ> О сч с

z а

LC>

СГ>

1 1

1 I

I 1

1 1

1 1

С> I

1 I

1 1

I 1 м

3 о CD .О >О оо

I I

I I

I 1

1 I

1 1

I 1 со

1 I

1 I м сч ч3

Ю сч СО !

Ю м

1 I

1 1

1 I

1 I

1 1 л

1 1

1 1

>3 м

CD

С3 и

Э

СГ>

1 л о

О1 !

1 1 !

1 .О 1

1 1

1 1!

Ю

>С!

СГ> СГ3

CD

CO !

Ю

0 Ъ

D! .О

S Iи

Y O

СЕ о х а и щ

Z3

S

Зс

D3 с

СГ>

Ю м

"О

CD сч

О > -С м

Э с

s !- S

1- О

YOLK

1

ct о х а и щ

z м

1 1

z э а s

DSZ

Z N Щ

o m 3У CLИ

Ю о

CD о

-Р

СС > сч

«Ю

Ю СЧ

«Ю о

CL о

I- оо

Щ

С3

lD о о

3> И

Э о Ф

>S с z>

z о. э а с с

S Зо х с

С>3 Э с с> с оо о - с

CC

S а

Щ

S х о а щz. с о m

О3

ZС3 С э о

>3>

IU

Iо с и

S с х о

Щ Щ а

С3 а о о. о

IЩ

S с

3О

Щ

Iс>

s а а э

c z

3- Z

Щ S с0

S Q с с о с а s с о с

Е а

D>

S с

S а

fU Э о

С3 а Б с

Э CL !

О

Щ

s z

Щ

CU S

mхс

SQO с с*

o L. m о. s

АСС!

s o с

lU

r.

Щ S

C>3 Y

Б Я с с о 1а к дс

s o с

IU S

С3

s Q с с о с а s с

s o

I C

Щ S

С>3 У С

sQo

c, c;

o L- m ак3хс m

s o с а

Щ IU

z 1а о о с со и

s x сч с, 1 I

1 1

I I

I 1

1 1

1 I

1 1

1 1

1 СЧ 1 .О

1 1

I 1

1 1

1 1

1 1

1 I

1 1

I 1

1 I

I 1

1 I

I 1 м

1 1

1 1 ! 1

I 1

1 1

I 1

1 >D

1 Ю 1 !

1 1

I 1

1 1

I I

1 1

I 1

1 1

1 I ю о

1 1

I I

1 1

I 1

1 1

I о

1 3 1

I 1

1 1

1 1

I I

1 1

1 1 1 1 Ю

I 1

1 I

1 1

1 1

1 1

I 1

1 1

1 I

1 1

1 1

I I

1 СЧ

I 1

I 1

1 о

z

1 CU

I1 Сс)

1 I

1 I

I 1

М =Г >С! О м ю сч

Ю

- 3

Ю

>3 \

-т

CD

СГ3 о сч

-т

СГ\

Ю !

CO сч

ll3

Cf о

СО

-Л

1

1

1

I

1

1

1

I

1

1

1

I

1

1

1

1

I

I

I

I

I

1

I

I

I

I

I

I

1

1

1

1

1

I

I

1

I !

I

I

1

1

1

I

1

1

1

I !

I

1

1

1

I

Ъ

1

I

1

I !

I

I

l

1

I !

968069

Формула изобретения

Составитель О. Скородумова

Редактор Г. Волкова Техред И. Верес Корректор А. Гриценко

За каз 7259/40 Тираж 505 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий! 13035, Москва, Ж вЂ” 35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП «Патент», г. Ужгород, ул. Проектная, 4

1. Способ стабилизации декстраназы Penicillium funiculosum, предусматриваюший сорбцию фермента на бентоните при рН

3,5 — 4,5, отличающийся тем, что, с целью повышения срока хранения фермента без снижения активности, полученный сорбат обрабатывают 10 — 25%-ным водным раствором этанола.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что бентонит используют в количестве 2 — 3%

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Патент США № 3981989, кл. 424-50, 1976.

2. Патент США № 3991177, кл. 424-50, s 1976.

3. Максимов В. И., Данилова Т. И. Хасирджева А. К. и Молодова Г. А. Стабилизация препаратов декстраназы Pen. funiculosum u

Fusarium solani при нагревании и лиофилизации. Прикладная биохимия и микробиология, 1979, XV, вып. 6, 846 — 851.