Способ количественного определения циклических нуклеотидов

Способ количественного определения циклических нуклеотидов

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Союз Советских

Социалистических

Республик

ОП ИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ ()972402 (6l ) Дополнительное к авт. свнд-ву (22) Заявлено 27.04.81 (21) 3282265/28 13 с присоединением заявки № (23) Приоритет

Опубликовано 07.11.82. Бюллетень №41

Дата опубликования описания 07. 1 1. 82 (51)М. Кл.

G,01 М 33/48 еооударотаенный комитет

СССР во делам нзооретеннй и открытий (53) УДК 547 8 (088. 8) -".; (, .i «ig

А. П. Хохлов, В. К. Малаховский, Т. Н. Ненао ева и B. С. Коноплев . i- i т i Q

" Ф

i i.,; Öß ; 1 i.°.

$j,Ð ", )fj т. 1, (72) Авторы изобретения

-1-ый Московский ордена Ленина и ордена Трудового ра

Знамени медицинский институт им. И. М., Сеченова (7I ) Заявитель (54) СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Ш4КЛИЧЕСКИХ НУКЛЕОТИДОВ

Изобретение относится к медицине и биологии и предназначено для идентификации циклических нуклеотидов в биологических жидкостях и тканях.

Известен способ количественного определения циклических нуклеотидов в биологичаеком материале путем экстракции пробы спйртом, высушивания экстракта, растворения осадка в буфере, инкубации пробы при 0 С в црисугствии связываюо

1О щего белка и меченого нуклеотида, филь рования, отмывания несвязавшейся метки с последующим радиометрическим измерением количества циклических нуклеотидов (1) .

Однако известный способ длителен по времени анализа.

11ель изобретения — ускорение способа.

Поставленная цель достигается тем, что при осуществлении способа количественного определения циклических нуклеотидов в биологическом материале путем экстракции пробы спиртом, высушивания экстракта, растворения осадка в буфере, инкубации пробы при 0 С в присутствии связывающего белка и меченого нуклеотида, фильтрования, отмывания несвязав шейся метки с последующим радиометрическим измерением количества циклических нуклеотидов, инкубацию пробы проводят непосредственно на участке милипорового фильтра, покрытого гидрофобным материалом.

Способ осуществляется следующим образом.

Пример 1. Определение содержания циклического

3 5-аденозинмонофосфата (цАМФ) в ткани скелетных мышц больного миопатией

Дюшена.

Биопта г мьппечной ткани немедленно погружают в жидкий азот, затем гомогенизируюг в 3-5 мл кипящего этанола, центрифугируют при 5 000 об/мин 15 мин, упаривают досуха при 40оС. Осадок растворяктг в 0,5 мл буфера, содержаше072402

Стандарты, Ск, пк моль/мл, 1,25

1095 1055

717 677

464 424

1250 1210

2,0

3,11

497

Образец Сх

1,74

ro 5 мМ трис- НСЕ, 0,4 мМ ЭДТА, рН 7,4. 15 мкл исследуемого образца переносят на гидрофобное покрытие милипорового фильтра, добавляют 15 мкл

Н цАМФ и 30 мкл цАМФ-связывающего белка. Инкубируют 30-45 мин при 0 С.

Затем фильтры промывают хододным буферным раствором, содержащим 5 мМ

КН РО4 и 0,5 мМ ЭДТА рН 7,4; высушивают, помещают в толуольный сцинтил- щ лятор и измеряк г уровень радиоактивности HB сцинтилляционном счетчике.

В таблице приведен расчет содержания ll/ÀÌô.

Содержание цАМФ в образце опреде(со лязг по формуле — — 1 К. сх

Коэффициент К (тангенс угла наклона)

К=, =4

М

Сл. содержание цАМФ: (— — 1) . 4= 2,96.

1108

1150

В пересчете на мг белка, содержаше- 25 гося в пробе, концентрация цАМФ составила 3,52 пкмоль. При определении концентрации цАМФ известным способом расчеты проводятся аналогично и содержание нуклеотица в данном образце соста- ЗИ вило 3,7 пкмоль/мг белка.

Пример 2. Определение содержания циклического 3 5гуан озинмонофосфата

35 летных мьшш больного боковым амиогрофическим склерозом.

Экстракцию цГМФ проводят так же как цАМФ. Затем 30 мкл исследуемого образца переносят на т.идрод .,бное покры тие милипорового фильтра, добавляют 15 мкл Н цГМФ и 15 мкл антисыворотки.

Каплю инкубируют 30-45 мин при 0-2 С. Дальнейшие операции аналогичны проводимым при определении цАМФ. Содержание нуклеотида рассчитывают стандартным методом. Концентрация цГМФ, определенная известным способом, сосгавила 1,56 пкмоль/мг белка, а предлагаемым способом-1,61 пкмоль/мг белка.

4

Использование предлагаемого способа позволяет без снижения точности умень/ шить количество используемых реактивов и тем самым снизить стоимость анализа в 3-4 раза. Одновременно сокращается время проведения анализа и трудоемкость оп ер аций.

2 1726 1686

Ф ормула изобретени:-.

Способ количественного определения циклических нуклеотидов в биологическом материале путем экстракции пробы спиртом, высушивания экстрактa, растворения осадка в буфере, инкубации пробы при 0 С в присутствии связывающего белка и меченого нуклеотида, фильтрования, отмывания несвязавшейся метки с последуюшим радиометрическим измере.—. нием количества циклических нуклеотидов, о т л и ч а ю ш и и с я тем, что, с целью ускорения способа, инкубацию пробы проводят непосредственно на участке милипорового фильтра, покрытого гидрофобным материалом. !

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Балденков Г.Н. Изучение механизмов регуляции активности аденилатциклазы гормонами.,Канд. дис. М., МГУ, 1 979.

ВНИИПИ Заказ 8507/35 Тираж 887 Подписное

Филиал ППП Патент, г. Ужгород, ул. Проектная, 4