Способ получения l-треонина

Способ получения l-треонина

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-ТРЕОНИНА, предусматривающий приготовление посевного материала путем выращивания продуцирующих его микроорганизмов вида Escherichia coli в жидкой среде в присутствии гидролизата или автолизата белоксодержащего субстрата и пенициллина , введение посевного материала в ферментативную среду, содержащую источники Углерода, азота и минеральные соли, ферментацию в глубинных условиях с последующей обработкой культуральной жидкости и выделение.м целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода треонина, снижения продолжительности ферментации при одновременном уменьшении расхода сырья, при приготовлении посевного материала из вида Escherichia coli используют штамм Escherichia coli ВНИИ генетика 472 Т-23, выращивание которого осуществляют при рН 6,5-7,5 путем дробного введения в посевную среду аммиачной воды.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН (19) (11) (Sl)S С 12 Р 13/08

8,if g.ЙИ)((, }

ЬйБЯ1

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

f10 ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

IlPH П(НТ СССР (21) 3302278/28-13 (22) 16. 06.81 (46). 23.08.90. Бюл. У 31 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов (72) В.А.Лившиц, А.К.Соколов, Т.А.Бачина, В.Г.Дебабов, Н.И.Щданова, Ю.И.Козлов, А.В.Беларева, М.М.Гусятинер, Е.М.Хургес, М.А.Гулько, Г.Х.Тевелев, Т.М.Позднякова, Н.А.Горячева, В.Н.Мошенцева, . S.À,ÐåáåHòèø, А.Ф.Шолин и Н.К.Янковский (53) 668.394 (088.8) (56) Авторское свидетельство СССР

Ф 904325 ° кл. С 12 D 13/06, 1980. (54)(57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-ТРЕОНИНА, предусматривающий приготовление посевного материала путем выращивания проЮ

Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к способу получения незаменимой аминокислоты - L-треонина, применяемой в качестве компонента различных питательных смесей медицинского назначения, добавки в пищу человека и в корм животных, а также как реактив для фармацевтической и химической промышленности и как ростовой фактор для микроорганизмов, продуцирующих другие аминокислоты, например L-лизин, L-гомосерин.

2 дуцирующих его микроорганизмов вида

Escherichia coli в жидкой среде в присутствии гидролизата или автолиза та белоксодержащего субстрата и пенициллина, введение посевного материала в ферментативную среду, содержащую источники углерода, азота и минеральные соли, ферментацию в глубинных условиях с последующей обработкой культуральной жидкости и выделением целевого продукта, о т л и ч а ю— шийся тем, что, с целью повышения выхода треонина, снижения продолжительности ферментации при одновременном уменьшении расхода сырья, при приготовлении посевного материала из вида Escherichia coli используют штамм Escherichia coli ВНИИ генетика

472 Т-23, выращивание которого осуществляют при рН 6,5-7,5 путем дробного введения в посевную среду аммиачной воды.

Известен способ получения L-треонина с использованием штамма Escherichia co}i ВНИИгенетика 472 Т, способного усваивать сахароэу и. устойчивого к треонину и гомосерину. Способ предусматривает при культивировании плаэмидного продуцента выращивание посевного материала на жидкой посевной среде с последующим введением посевного материала в ферментационную среду. На стадии выращивания посевного материала в посевную среду вносят источники углерода, азота, минераль974817 ные соли, мел, а также гидролизат белоксодержащих субстратов и пенициллин.

После глубинной ферментации культуральную жидкость обрабатывают н выде5 ляют целевой продукт.

В известном способе при культивировании плазмидного продуцента треонина значение рН к концу выращивания посевного материала снижается до 5,0-

5,5 ° При внесении посевного материала с низким значением рН в ферментационную среду, которая имеет нейтральное значение рН, происходит задержка начала развития культуры на несколько часов, связанная с адаптацией культуры к новым условиям культивирования, что приводит к увеличению продолжительности ферментации. Максимальное накопление Ь-треонина (до 32 г/л) достигается за 55 ч ферментации. При этом на синтез 1 г аминокислоты расходуется 4 г углеводов °

Недостатками указанного метода 25 получения L-треонина являются недостаточно высокий уровень накопления

L-треонина и большая продолжитель-, ность ферментации.

°

Целью предлагаемого изобретения 30 является повышение уровня накопления треонина в кудьтуральной жидкости и сокращение продолжительности ферментации при одновременном уменьшении расхода углеводов на синтез амн- 35 нокислоты, Поставленная цель достигается тем, что в способе получения L-треонина, предусматривающем приготовление посевного материала путем выращивания 40 продуцирующих его микроорганизмов вида Escherichia coli в жидкой среде в присутствии гидролизата или автолиэата белоксодержащего субстрата и пенициллина, введение посевного мате- 45 риала в ферментационную среду, содержащую источники углерода, азота и минеральные соли, ферментацию в глубинных условиях с последующей обработкой культуральной жидкости и выде- . лением целевого продукта, предложено согласно изобретению прн приготовлении посевного материала из вида

Escherichia coli использовать штамм

Escherichia c6li ВНИИгенетика 472

Т-23, выращивание которого осуществ55 ляют при рН 6 ° 5-7,5 путем дробного введения в посевную среду аммиачной воды.

Способ позволяет получить до 55 г/л

L-треонина за 40 ч ферментации при минимальном расходе углеводов до 2,5

2,5 г на 1 r треонина.

Штамм Е.coli ВНИИгенетика 472 Т-23 депонирован в Центральном музее промышленных микроорганизмов и имеет регистрационный номер ЦМПМ В-2307. Штамм

" Е.со11 ВНИИгенетика 472 T-23 и штаммпрототип Е.coli ВНИИгенетика 472 Т имеют общего предшественника — штамм

Е.coli ВНИИгенетика 472, который получен введением детерминантов и сбраживания сахарозы в клетки штамма Е.coli

ВНИИгенетика М-1, и являются мутантами этого штамма, устойчивыми к треонину и гомосерину при их содержании в среде более 0,5 г/л. Штамм Е.coli

ВНИИгенетика 472 Т-23 отличается от штамма Е.coli ВНИИгенетика 472 Т стабильным сохранением признака устойчивости к укаэанным аминокислотам,и более стабильным сохранением плазмиды в процессе культивирования на обогащенных питательных средах, а также более высокой удельной продуктивностью (см. табл.1).

Штамм Е.coli ВНИИгенетика 472 Т-23 имеет следующую культурально-морфологическую характеристику.

Морфология. Грамотрицательные слабоподвижные тонкие палочки с закругленными концами размером 1,5-2 мкм в длину.

Культурально-физиологические признаки. Мясо-пептонный агар. Через 24 ч о

1 роста при 37 С обраэует круглые беловатые полупрозрачные колонии диаметром 1,5-3 мм, поверхность колонии гладкая,. края ровные или слегка волнистые, центр колонии слегка припод" нят, структура однородная, консистенция пастообразная, легко эмульгиру-- ются.

Рост на агаризованной минимальной среде Адамса. Через 40-48 ч роста прн

37 С образует колонии 0,5-1 5 мм в диаметре, серовато-белые, полупрозрачные слегка с блестящей поверхностью, ослизняющиеся через 4-5 суток.

Рост в мясо-пептонном бульоне.

После 24 ч роста при 37 С наблюдается сильное, равномерное помутнение, небольшой осадок, запах характерный.

Рост в жидкой минимальной среде

Адамса. Через двое суток роста с аэрацией при 37 С наблюдается сильное

974817 мере необходимости. На 27 часу ферментации концентрация треонииа в культуральной жидкости достигает 48 г/л, на 40 часу — 55 г/л. Расход сахара на 1 r треонина на конец ферментации составляет 2,5 r.

Для выделения треонина 400 мл культуральной жидкости нагревают в течение 5 мин до температуры 100 С, затем 10 биомассу отделяют центрифугированием.

Полученный нативны9 раствор упаривают под вакуумом до 80 мл, добавляют к нему 20 мл этанола и кристаллизуют о

7 ч при температуре 0 С. Кристаллы фильтруют и сушат. Получают 15,4 -г

Ь-треонина.

Пример 2. Продуцент треонина и условия выращивания посевного материала те же, что и в примере 1. Отли- 20 чие состоит в том, что значение рН в ходе выращивания посевного материала поддерживают иа уровне. 6,5. Через

24 ч культивирования посевной-материал с титром клеток 1-10 (доля кле- 25 ю ток, утративших плаэмиду, не более

6X) в количестве 10Х вносят в ферментационную среду следующего состава,Х:

Глюкоза 2 .Аммоний сернокислый 0,5 30

Калий фосфорнокисяый однозамещенный 0,1

Ферментацию ведут в тех же условиях, что и в примере 1, с тем отличием, что в качестве рН-статирующего агента используют питательную добавку, состоящую из смеси 40Х раствора глюкозы и 25Х водного раствора аммиака в соотношении 6: 1 (по объемам).

Через 40 ч ферментации накопление gp треонина составляет 41 г/л. Расход глюкозы на 1 г синтезированного треонина составляет 3.,1 г.

Дпя выделения L-треонина 400 мл культуральной жидкости нагревают в 45 течение 20 мин до 60 С, затем биомасо су отделяют центрифугированием. Полученный нативный раствор пропускают через колонку со смолой КУ-2-8 в Н форме. Сорбированный треонин элюируют

ЗХ -ным раствором аммиака, упаривают до содержания сухих веществ SOX добавляют этанол в количестве 1/3 от объема упаренного алюата и кристаллизуют в течение 12 ч при температуре

0 — (+5) С. Кристаллы L-треонина отфильтровывают, промывают и.сушат.

Получают 15 г Ь-треонина (выход составляет 92X). Анализ чистоты продукта методом тонкослойной хроматографии (10 мкг) показывает отсутствие других аминокислот.

Пример 3. Продуцент треонина и условия выращивания посевного материала те же, что и в примере 1. Отличие состоит в том, что в качестве питательной добавки s посевную среду вместо автолизата дрожжей вносят гидролизат БВК в количестве О, 1Х (в расчете на исходный БВК). Посевной материал выращивают в условиях рНстатирования при рН 7,5 + 0,1 в течение 24 ч. Титр клеток в готовом посевном материале 0,9 10 кл/мл (доля, <о клеток, утративших плазмиду, не более

8X). Посевной материал в количестве

10 используют для засева ферментационной среды следующего состава, Х:

Сахароза 8

Аммоний сернокислый О, 5

Калий фосфорнокислый однозамещенный 0,1

Ферментацию ведут в тех же услови-. ях, что и в примере 1. Через 13 ч культивирования, когда концентрация углевода в среде снижается до, 5Х < в ферментационную среду вносят дополнительно еще 4 сахарозы. К 30 часам ферментации сахар утилизуется полностью и накопление треонина составляет

39 г/п. На синтез 1 г треонина расходуется 3,0 г сахарозы.

Для выделения Ь-треонина культуральную жидкость обрабатывают также, как в примере 1. Полученный нативный раствор упаривают до содержания сухих веществ 30 и кристаллизуют при охлаждении (+3-5 С). Получают технический препарат Ь-треоннна с содержанием основного вещества 90 .. Выход продукта составляет 75Х.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет снизить продолжительность ферментации до 30-40 ч по сравнению с 30-55 ч по известному способу. При этом выход составляет 39-55 г/л Ьтреоиина (в известном способе максимальный выход, до"тигаемый за 55 ч ферментации, составляет 32 г/л). Минимальный расход углеводов на синтез

1 г Ь-треонина составляет 2,5 r, что на 40 . ниже, чем в известном, в котором на синтез 1 г аминокислоты расходуется 4 г углеводов.

5 97481 равномерное помутнение, запах харак- терный.

Рост по уколу в мясо-пептонном агаре. Хороший рост о всему уколу.

Рост на желатине. Желатину не разжижает.

Рост на молоке. Хороший рост с коагуляцией молока.

Образование индола. Индол обра- 10 зует, Рост на различных углеводах. Хорошо растет на сахарозе, глюкозе, лактозе, маннозе, галактозе, ксилозе, фруктозе, глицероле, маннитоле с об- 15 разованием кислоты и газа.

Отношение к антибиотикам. Устойчив к пенициллину.

Патогенность. Не патогенен.

Содержание плаэмид. Клетки содержат многокопийную нлазмиду рУМ (мол.вес 5.8 мегадальтон), обеспечивающую устойчивость бактерий к пенициллину н несущую гены треонинового оперона. 25

Способ осуществляют следующим образом.

Клетки продуцента Е.coli ВНИИгене-, тика 472-Т-23 выращивают на агаризованной минимальной питательнои среде 30 в присутствии пенициллина, затем суспензией клеток, смытых со скошенного агара, засевают жидкую питательную посевную среду, содержащую источники углерода, азота, необходимые минеральные соли, питательную добавку в виде гидролизатов белоксодержащнх субстратов и пенициллин, Посевной материал выращивают в ферментере, оснащенном системой рН-статирования, 40

o при температуре 35-37 С и непрерывном аэрировании и перемешивании в течение

20-30 ч. Значение рН в ходе выращивания посевного материала поддерживают на уровне 6,5-7,5 дробным введением 45 в ферментер аммиачной воды. Приготовленный таким образом посевной материал используют для засева ферментационной среды, содержащей источники углерода (например сахар или глюкозу), 50 источники азота и необходимые минеральные соли. Ферментацию осуществляют в ферментерах, оснащенных системой рН-статирования, при рН 6,5-7,5, температуре 35-32 С и непрерывном перемешивании и аэрировании. В качестве рН-статирующего агента применяют либо аммиачную воду, либо сбаллансированную по углероду и аммиаку подпитку.

7 6

Продолжительность ферментации 30-40 ч.

На 40 ч культивирования в культуральной жидкости накапливается до

55 г/л треонина. Для выделения треоннна культуральную жидкость подвергают быстрому нагреву в течение не более

20 мин до температуры 60-100 С, с целью предупреждения лизиса клеток, затем биомассу отделяют центрифугиро- ваннем или сепарированием. Выделение треонина из полученного нативного раствора осуществляют одним из изве- . стных способов.

Способ поясняется следующими примерами.

Пример 1. Культуру продуцента

Е.coli ВНИИгенетика 472 Т-23, выращенную на агаризованной минимальной среде с глюкозой в присутствии пенициллина, пересевают на жидкую посевную питательную среду следующего состава, %:

Сахар технический 4

Аммоний серно кислый 0,5

Калий фосфорнокислый двузамещенный 0,2

Магний сернокислый 0,04

Автолизат дрожжей 0,2

Пенициллин 0,01

Доза засева 1 ° 10 клеток в мл.

Выращивание посевного материала проводят в ферментере емкостью .0,5 л при аэрировании 0,5 л воздуха в минуту, перемешивании 900 об/мин, температуре 37 С. рН-статирование осущество ляют на уровне 7,0 0,1 путем автоматической подачи в ферментер аммиачной воды. Время выращивания посевного материала 20 ч. Титр клеток в готовом посевном материале 1 ° 10 кл/мп (доля

1о клеток, утративших плазмиду, не более

6%)., Посевной материал в количестве

10% вносят в ферментационную среду следующего состава, %:

Сахар технический 8

Аммоний сернокислый 0 5

Калий фосфорнокислый однозамещенный 0,1

Ферментацию проводят в ферментере с рабочим объемом 0,5 л, оборудованном системой рН-статирования. Режим ферментации: аэрированне 0 5 л/мин. перемешивание 900 об/мин, температура

37 С, рН-статирование на уровне 7,0й

«+О, 1 путем подачи аммиачной воды.

После исчерпания из ферментационной среды начальной порции сахара его вносят дробно в несколько порций, по

974817

Сравнительная характеристика ытаммов

Е.со1 ВНИИгенетика 472 Т и 472 Т-23

Штамм

Максимальная треонину и пеницилгомосерину, X лину, Х

0,14

1-3

100

0,23

Редактор Е.Мисропова Техред М.Дидык

Корректор Т.Малец

Заказ 3086 Тираж 490 Подписное.ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат ."Патент", r.Óæãîðoä, ул. Гагарина, 101

ВНИИгенетика 472 Т

ВНИИгенети.ка 472 Т-23

Относительное содержание клеток, сохраняющих после 10 генераций на бульоне Хоттингера, устойчивость,к

82-98

98-99 удельная продуктивность г треонина г биомассы в ч