Иммобилизованные на полимерной матрице @ и @ -амидные производные нуклеозид-51-ди или трифосфатов в качестве сорбентов для афинной хроматографии и способ их получения

Иммобилизованные на полимерной матрице @ и @ -амидные производные нуклеозид-51-ди или трифосфатов в качестве сорбентов для афинной хроматографии и способ их получения

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

ОП ИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ. Союз Советских

Социалистнческнх

Республик

<и>977463 (61) Дополнительное к авт. свид-ву(22) Заявлено 1001.80 (21)2868371/23-04 с присоединением заявки ¹(23) Приоритет—

Опубликовано 3011.82. Бюллетень ¹44

Дата опубликования описания 301182 (Щ М. Кл.

С 07 Н 19/00G 01 N 33/50

Государственный комитет

СССР

II0 делам изобретений н открытий (53) УДК 547. 455 (088. 8) Г.Т.Бабкина, Д.Г.Кнорре и H.h.Ñåðáo (72) Авторы изобретения

Новосибирский государственный универСитет им. Ленинского комсомола и Новосибирский институт органической химии

Сибирского отделения AH СССР - - . у

{71) Заявители (54) ИММОБИЛИЗОВАННЫЕ НА ПОЛИМЕРНОИ МАТРИЦЕ P — И У-АМИДНЫЕ

ПРОИЗВОДНЫЕ НУКЛЕОЗИД-5-ДИ" ИЛИ ТРИФОСФАТОВ В КАЧЕСТВЕ

СОРБЕНТОВ ДЛЯ АФИННОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

И СПОСОБ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ

Изобретение относится к новым химическим соединения, а именно иммобилизованным на полимерной матрице производным — и я -амидов нук-: леозид-5 -ди- и трифосфатов, которые

1 являются сорбентами .для афинной хроматографии, наиболее сохраняющими средство лиганда к специфическим взаимодействиям с- ферментами, и способу их получения.

Иммобилизованные на полимерных матрицах производные р — и г-амидов нуклеозид-5 -ди- и трифосфатов могут быть использованы в биалогичес. кой химии, иммунологии, медицине, фармацевтической промышленности для выделения, очистки и разделения. био логически активных компонентов.

Афинная хромотография основана на уникальной специфичности биологических взаимодействий — биологическо го узнавания основного лиганда белком. Разделение основано на различном сродстве разных ферментов к одному и тому же субстрату или эффек» тору субстрата. Необходимым условием успешного проведения афинной хроматографии является создание такой матрицы, несущей лиганд, при контакте с которой лиганд сохранял бы сродство к Ферменту.

Известно, что модификация нуклео5,зид-5 -ди-- и трифосфатов по гетероциклическим основаниям или.по остатку рибозы резко снижает сродство к ферменту(1 1.

Фермент вообще не образует комплекса с иммобилнзованным аденозин-5

-дифосфатом, если его пришивка (ховалентное присоединение )осуществлено по остаткам рибозы.

Известна очистка фактора элонгации ЕЕ-2 из печени свиньи афинной хроматографией. В качестве сорбента используют сеффарозу с ковалентно связанным гуанозин-5 -трифосфатом

-8/6-аминогексил/-амино (ГТС, причем ковалентное присоединение осуществляют по гетероциклическому основанию гуанидовой кислоты(2 l.

Однако в данном случае не достигается полная очистка белка и необходима дополнительная стадия — хроматография на КМ-сефадексе.

Известно также использование в афинной хроматографии парааминофениловых р -эфиров АТФ и дАТФ иммобилизованных на бромциансефарозе для выделения Т4-специфичной рибонуклео977463

MO Р-0

-О бЕу

О (it)

О.Х H Н о о

О 0

0H OH где 1

II

III

V тидредуктазы из экстракта E.coIi, индуцированной фагом Т4 (3 3.

Однако получение указанных сорбен- тов является процессом трудоемким и многостадийным, включающим три дос таточно трудоемких стадии синтеза 5 ,пара-нитрофениловых эфиров АТФ в абсолютных растворителях, а также ионообменную хроматографию, хроматографию на силикагелевых пластинах, центрифугирование. Следующая . t0 стадия — получение пара-аминофенилового эфира АТФ над палладием, затем сиова хроматография на ДЭЛЭ-сефадексе А-25 и обработка пара-аминофенилового эфира АТФ активированной бром- 5 циансефароэой. Метод иммобилизации описан только для АТФ и МАТФ, для остальных нуклеоэид-5 -ди- трифос1 фатов не описан.

Цель изобретения - получение

20 новых высокоэффективных сорбентов для афинной хроматографии, сохраняющих максимальное сродство лиганда(к ферменту.

Поставленная цель достигается путем, получения новых иммобилизованных на полимерной матрице р - и

>l г -амидных производных нуклеозид-5-.

-ди- или трифосфатов..общей формулы

-о р > бн л

t нуклеознд-5 -трифосфат; водорастворимый карбодиимид, — циклический нуклеозид-5

-триметафосфат (активное промежуточное соединение); полимерная матрица со свободными NH>- группами, - амидное производное нуклеоэид-5 -трифосфата (целевой продукт). 65 где n — 2 или 3;

R — полимерная матрица

Х Н HI OHp

A - природное основание.

Присоединение производных нуклеозид-5 -ди- или трифосфатов по

/5 — или р" -фосфатной группе позволяет не затрагивать наиболее специ1 фичные части. молекул нуклеозид-5 -дни . трифосфатов.

Соединения формулы.(1) получают путем взаимодействия нуклеозид-5

-ди- или трифосфатов общей формулы где n, Х и A — приведенные выше значения, подвергают взаимодействию с 10-15кратным избытком карбодиимида в водной среде при рН 5-6 и 10-15 С с добавлением в реакционную смесь полимерной матрицы, содержащей свободные аминогруппы.

Способ получения, например у "амидных производных нуклеозид-5 -трифосфатов описывается следующей схемой

Известен способ получения иммобилизованных ферментов с помощью водорастворимого карбодиимида, атакующего первичные аминогруппы белка 4 ).

И хотя водорастворимый карбодиимид используется в данном способе для ( иммобилизации субстратов нуклеозид-5

-ди- и трифосфатов в качестве конденсирующего агента, так же как и в случае иммобилизации ферментов, он

977463 осуществляет другую реакцию. Реакция идет через активацию фосфорильных групп субстратов — циклический нуклеозид-5 -триметафосфат (активное промежуточное соединение) и конечным (целевым) продуктом реакции является иммобилиэованный нуклеоэид-5

-трифосфат, который являясь афинным аналогом субстрата, легко узнается соответствующим ферментом. A это позволяет в свою очередь использовать афинные аналоги субстратов (афинные сорбенты) для получения высокоочищенных ферментов .

Осуществление процесса в определенных параметрах позволяет осуществить процесс без затрачивания наиболее специфичных частей молекулы нуклеозид-5 -ди- или трифосфатов.

Способ осуществляется следующим образом.

Взаимодействие нуклеозид-5 -ди1 или трифосфатов с карбодиимидом идет через образование активного проме.жуточного соединения, которое обладает способностью вступать во взаимодействие с нуклеофилами, представляю,щими собой полимерную матрицу со свободными аминогруппами. За реакцией образования активного.промежуточнога соединения следят по расходу кислоты,:необходимой для подцержания постояннога значения рН реакционной смеси, равного 5-6. Процесс ведут

Прн 10 15 С. После дОстижения максимальной концентрации активного промежуточного соединения в реакционную смесь добавляют соответствующую нерастворимую полимерную матрицу.

Выход целевого продукта составляет 85-90% по исходному нуклеоэид-ди- или трифосфату. Полученный продукт анализировали путем проведения

Аминоэтилцеллюлоза (AE-целлюлоза)

1 — бн,- Ыг- ггпу

Гидразид карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ-гидразид)

0 — бНг — б .

l мн — мн

Амнноэтилированное производное полиакриламида (АЕ-биогель) .

0 як(был) ни

Гексаметилендиаминсефароэа .(АНсефароэа 4В) 30

) — 2п (ЫЙ) г к2

Данные по синтезированным иммобилизованным на полимерных матрицах р — и г -амидным,производным нукле40 оэид-5 -ди- и трифосфатам представлены в табл.1 ° кйслотного гидролиза, хроматографии на бумаге, снятия уФ-спектров. Опре. деление емкости сорбента проводили по .количеству иммобилиэованных нуклеозид-5 ;ди- или трифосфатных остатков на 1 r сорбента.

На основании предлагаемого способа синтезированы сорбенты, для получения которых использовались следующие нуклеозид"5 -ди- или трифосфатйг

1О аденозин-5г-дифосфат и -трифосфату дезоксиаденозин-5 -трифосфат р гуаноэин-5 -дифосфат и -трифосфатг ури1 дин-5 -трифосфат; цитизин-5 -три фосфат °

f5 В качестве полимерных матриц .гиспользованыг

977463

Ю

Ю

Ю

Ю

C) л

Ю

C)

Ю

Ю -3

Ю

I

01 о о

4О

: 4 д;о с н 133

Х yIÖ

l Э

И3

» ж

С4 Ф

4О

1 0I

« О ж о к

0I х L

° « а-3

IA

° а с-! 4

Ф«

Ю

Ю

%-!

C)

C)

С Ъ

Ю

Ю

Ю

Ф

О1

g g

ФК эо

333 В о

_#_ 6) !I3.

eon ээе йоЭ эоо их1

5 II f f

ЗKgk I х

1 IL

I к ), 00, н >" о ;! даю,фо 3 3 Е!, Х1 оп о О

"1 0601314

К1 ХОЕ О! Za, 333Х

О1 е000»

1 и131хи щ I Ы & 9! ао!ою чl Ж4Ф3«! 3 О оа эх ж о КФ

I ХК 43«! орох и

Ф3ж

1 1 о ! o! åå ! OI XI ! I!!F0,u

1 Ов ! ЭОМ3

1 О»5Э

1AЖ I Е

I о

1 Э 4 оа

1 9 4ЦД ! Boor, омао

1 Х3!3ВЭ ! о3 о3х ! Ох!4»

1ue4X

1 .1

1

1 О

1 4

1 О х ! ж

I М

I Е63 а!

3 Ж

I &iэ

I Ж О

1 90I ! zo

14u

I Э

I 0I

1 &

1 .ЭХ4

1 Д 3«К ! номад

04ЭМК

IОООМУ

,1,1 3» 1 ДИ

g»

1 М 4 и сч! ож! ox

1 Х о

1)I

1 Ц Ф! oe

I Х0

1uo

1жu

1

1

1

)

I

I

I

I

I

I

I

1

Aj

М I

3е 1

Э I

О I

3

I

1

1

1

Ю а Л «П «3 «3 3 (Ч (Ч а-3.3! Ф Р,Д ф Р3 ь ьа

1 ГГ 4

Г (о

Ф 3

3 (II

5

1 «г ссссо! 7

1 Ф( ци в9 мэом

N 3 4 ох йо и О «d а

° 4 I

-ссссо

977463

Таблица 2

Х „(нм> (нм ) анализируемые соединения система

A Б рН 2 рН 7 рН 11 рН 2 рН 7 рН 11

Аминоэтилцеллюлозный аналог нуклеозид 5 -диили трифосфата после кислотного гидролиэа

-PPA

-PPG

- 1 РРА

230 227

0,07 0,30 257 259

0,06 0,09 256 252 258 228 224 . 230

0,04 0,20 257 259 230 227

Пример 1. Синтез аминоэтилцеллюлоэных аналогов нуклеоэид-5

-ди- и трифосфатов проводят в термостатированной кювете при 10-15ОC.

45 мкмоль нуклеозид-5 -ди- или

t трифосфата (аденоэин-5-ди- или три фосфата; гуанозин-5 -ди- или трифос

I фата; цитидин-5 -ди- или трифосфата; уридин-5 -трифосфата) растворяют в 15 мл воды, рН доводят до

5,6. При непрерывном перемешивании 1О добавляют 380 мг водорастворимого карбодиимида. Постоянное значение рН поддерживают при непрерывном подтитровывании 0,5 N соляной кислотой, контролируя рН с помощью потенциометра ЛПУ-.01. Через 30 мин добавляют 1 аминоэтил-целлюлозы. Реакционную смесь наносят на стеклянный фильтр, промывают 0,5 14 КС1 до исчезновения оптической плотности, затем — водой. Синтезированный продукт анализируют проведением кислотного гидролиза, хроматографией на бумаге и снятием УФ-спектра.

Пример 2. Синтез гидразид карбоксиметилцеллюлозного аналога аденозин-5 -трифосфата (АТФ) inpour;одят при сохранении всех параметроз и условий, указанных в примере 1.

Полимерную матрицу — гидраэид карбоксиметилцеллюлозу добавляют в количестве 0,5 r.

Пример 3. Синтез аминоэтилированного производного полиакриламида с ковалентно связанным аденоэин- и гуанозин-.5 -трифосфатами про- 35 водят при сохранении всех параметров и условий процесса, указанных в примере 1. Полимерную матрицу — аминоэтилированное производное полиакриламида добавляют в реакционную смесь 40 в количестве 0,5 г.

Пример 4. Синтез гексаметилендиаминсефарозного производного аденозин- и гуаноэин-5 -ди- и трифосфатов

1 проводят при сохранении всех парамет-45 ров и условий процесса, указанных в примере 1. Полимерную матрицу — гексаметилендиамннсефароэу добавляют s реакционную смесь в количестве 1 r.

При проведении повторных реакций с синтезированным сорбентом можно достичь дополнительной Иммобилизации производных нуклеоэид-5 -ди- или трифосфатов, что позволяет получать сорбенты заданной емкости.

Кислотный гидролиз синтезированных продуктов для количественного определения амина и нуклеотиднога материала проводят в 1 NHCI в течение

2-х ч при 40 С. Затем гидролизат нейтрализуют, наносят на стеклянный фильтр. Нуклеотидный материал замеряют на спектрофотометре.

В результате кислотного гидролиза происхоцит разрыв фосфоамидной связи - -P= и в реакционной смеси полу4 чают исходный соответствующий нукле1 озид-5 -ди- или трифосфат и полимер-. ную матрицу, несущую свободную амнногруппу.

Нуклеоэид-5 -ди- или трифосфат, предварительно отделенный от полимерной матрицы (на стеклянном фильтре, анализируют методом бумажной хроматографии для определения R и доказательства индивидуальности продукта в системах растворителей: (A )этанол : 1 Х ацетат аммония, 7:3 по объему, рН 7,5; (В) 1Нэомасляная кислота : конц. аммиак : вода, 66:1:33, рН 3,7.

УФ-спектры снимают на автоматическом регистрирующем спектрофотометре при рН 1,2,7,11 и концентрации 0,75 ° 10 H по нуклеотидному материалу.

Таким образом, анализ синтезированных новых химических соединений, иммобилизованных на полимерной матрице производных р -и у -амидов нуклеозид-5 -ди- и трифосфатов показал, что соединения химически чисты, строение их доказано и данные анализа приведены в табл.2.

977463

Продолжение табл. 2 „„,„ (нм) tTIаП.Анализируемые соединения рн 2 рн 7 рн11 рН 2 рН 7 рН 11

-PPPdA

-PPPG

-PPPU

-РРРС

0,20 257

0,04

256

0,03 0,05

0,04 0,08

0,04 0,07

262 261

230 239

Гидролиэ карбоксиметклцеллюло з ный. аналог аденозин-з-трифосфата после кислотного гидролиэ а.

-РРРР

0,04 0,20 257 259

230 227

0,04 0,20 257 259 . 230 227

0,03 0,05 256 252 258 228 223 230

-PPA

-PPG ГекСаметиленди-аминсефароэное производное аденоэин- и гуанизин-5-ди- и трифосфатов

0,06 0,09 256 252 258 228 224 230

-PPG

-PPPA

" PPG

0,04 О, 20 .257 259

230 227

0 05 256 252 258 228 224 230

0,03

«»

Во всех синтезированных р- и -амидных производных нуклеозид-5

-ди- и трифосфатов, иммобилиэованных5, на полимерных матрицах, фосфоавыдная связь стабильна в диапазоне рН от 6 до 11 и температуре от 0 до 50 С при указанных рН.

Синтезированные сорбенты обладают высоким сродством лиганда к специфическим взаимодействиям с ферментами,и могут быть использованы в качестве афинных сорбентов для выделения, очистки и разделения биологически активных компонентов. 65

Аминозтилированное производное полиакриламида с ковалентно свя занными аденозин-, и гуанозин-5-три1 фосфатами после кислотного гидролиза

259 230 227 г

252 l258 228 223 230

280 271 241 249

Пример 5. Афинная хроматография.

Испытания проводят на следующих сорбентах аминоэтилцеллюлоэный аналог гуаноэин-5 -дифосфата; аминозтилцеллюлозный аналог гуанозин-5 -трифосфата; аминоэтилированное производное полиакрнламида с ковалентно связан1 ным гуаноэин-5 -трифосфатом; гексаметилендиаминосефарозное производное гуаноэин-5 -дифосфата; гексаметилендиаминосефарозное производное гуаноэин-5 -трифосфата.

977463

Клетки Е.coIi MRE 600 разрушают с помощью звукового генератора УЗДН(174,2 (22 кГц, 3 = 0,5-0,6 ампер).

Белковый осадок, полученный из

105000 xg супернатанта насыщением сульфата аммония между 373 и 67%, 5 растворяют в буфере I, содержащем

2mM трио-НС1, рН=8,0, 10 m)1 ацетата магния, 2вМПТТ, 0,35 М НС1, 5mM

ЭДТА, -и проводят диализ йротив этого же буфера. 10

1 г влажного аминоэтилированного производного полиакриламида с коваf лентно связанным гуанозин-5-трифосфатом (ГТФ-АЕ-биогель) перемешивают с белком (20 о.е. 7 = 280 нм) в течение 3-4 ч при 4 C.. Смесь вносят в колонку и элюируют сначала буфером 1 до исчезновения оптической плотности белка (А =280 нм ), затем буфером II, содержащем дополнительно к составу буфера I 100,<МГТФ.

Фракции белка, содержащие EF-Tu активность, концентрируют и проводят диализ против 10 mM натрий фосфатного буфера (рН=7,0),содержащего

0,1Ъ SDS и 0,1Ъ р -меркаптозтанола.

Электрофорез белков проводят в полиакриламидном геле с SDS, Белок элюированный с афинной колонки, по данным электрофоретического анализа получен в индивидуальном состоя- . нии с молекулярным весом 4200044000. Сходные результаты были получены и с другими сорбентами.

В результате испытания установ- 35 лено, что синтезированные соединения могут быть использованы в качестве эффективных сорбентов для афинной хроматографии биологически активных компонентов, имеющих сродство 40 (афинность) к нуклеозид-5 -ди- и трифосфатом, таких как белковые факторы элонгации и другие.

Способ получения сорбентов экспериментально прост, а нх использо- 45 вание для выделения и очистки ферментов дает воэможность сократить этот многостадийный процесс практически до одной стадии. Сорбент легко регенерируется и может быть использован многократно.

Пример 6. Афинная хроматография.

Испытания проводят на следующих сорбентахг аминоэтилцеллюлозный аналог аденозин-5 -дифосфата; аминоэтилцеллюлозный аналог аденозин-5 —

-трифосфата; аминоэтилированное произ водное полиакриламида с ковалентно связанным аденозин-5 -трифосфатом; 60 гидразидкарбоксиметилцеллюлозный аналог аденозин-5 -трифосфата; гексамеI тилендиаминсефароэное производное аденозин-5 -трифосфата; аминоэтилI целлюлозный .аналог цитидин-5 -трифос- 65

Фата; аминоэтилцеллюлозный аналог ури-, дин-5 -трифосфата.

Все четыре субстрата (ATP, ГТР, УТР, ЦТР), иммобилизованные на нерастворимых матрицах, способны образовывать специфический комплекс с ферментами:

1) Креатинкиназу КФ 2.7.32.ATP: креатинфосфотрансфераза из мышц кролика выделяют по методу Кьюби.

В случае применения афинных сорбентов ткань мышц кролика разрушают; экстрагируют 0,3 И КС1 в буфере, содержащем 10 мМ трис-НС1 рН 85, 5 мМ уксуснокислый магний, 100 мИ уксуснокислый натрий, 1 мИ р -мер« . каптоэтанол, 10 мИ ЭдТА и проводят диализ против того же буфера A.

1 r влажного аминоэтилцеллюлозного производного аденозин-5 -трифос-! фата перемешивают с белком 50р = — 280 нм ) в течение 4-5 ч при 4оС

Смесь вносят в колонку и элюируют буфером Л до исчезновения оптической плотности белка(1=280 нм ). Затем буфером Б (к буферу A добавляют

ATP в конечной концентрации 100 мкМ), элюировали белок, который образовывает специфичный комплекс с сорбентом. До 70% исходной активности креатинкинаэы определяют во фракции, полученной при элюировании афинной колонки буфером Б (активность креатинкиназы измеряют потенциометрически,используя рН-метр марки рН-340). Эти данные свидетельствуют о том, что креатинкиназа образует достаточно прочный комплекс с афинным сорбентом, что хорошо согласуется с константой ингибирования К1, равной 4,8 10 Ъ по отношению к АТР для афинного реагента креатйнкиназы-амидного производного ATP.

2) Пируваткиназу (КФ 2.7.1 ° 40, АТР; фосфотрансфераза) выделяют иэ .бактериальной массы Е.coIi ИК1,"-600.

Клетки Е.со?1 обрабатывают, кйк указано в примере 5. Белковой осадок, содержащий большую часть ферментов клетки, полученный из 105000 хд супернатанта фракционированием сульфатом аммония, растворяют в буфере I, содержащем 10 мМ трис-НС1, рН 7.2, 10 мМ магний ацетат, 1 мМ р-меркаптоэтанол, 5 мМ ЭДТА. После каждого фракционирования сульфатом аммония ,осадки белка диализуют против того же буфера.

Поскольку для пируваткиназы донором кроме аденозин-5 -трифосфата (ATP) могут служить уридин-5 —

-трифосфат (УТР), цетозин-5 -трифосфат (ЦТР) и деэоксиаденозин-5-трифосфат (ДАТР), то в качестве афинного сорбента используют амнноэтилцеллюлозное производное ATP или

УТР, или ЦТР по О, 5 г каждого влажно

977463

ro сорбента смешивалось с 10,3 =

280 нм белка.

И второй вариант, когда три сорбента (аминозтилцеллюлоэное производное АТР, УТР и ЦТР) смешивают, в эквивалентных количествах, перемещи- 5 вают в течение 3-4 ч при 4 С с о

30 A =--280 белка и затем смесь вносят в колонку. Как s первом варианте, так и во втором, афинная колонка злюировалась буфером Х для удаления 10 всех балластных белков (до исчезновения оптической плотности белка

-" 280), Буфером Х1(буфер 1 с добавлением соответствуюцего субстрата до

100 мкй концентрации его ) злюировали белок, образующий специфический комплекс с афинным.сорбентом. Об образовании комплекса в каждом случае судят по количеству белка, вымываемого с афинной колонки буфером I и буфером П с определением в каждой фракции пируваткиназной активности.

В результате испытания установлено, что ируваткиназа образует комплекс с афйнными сорбентами, причем более прочный комплекс (почти в 2 раза) образуется в случае испытания трех сорбентов одновременно.

Таким образом, данные .сорбенты обладают высоким сродством лиганда к специфическому взаимодействию фермента, которое позволяет многостадийные трудоемкие процессы выделения и очистки ферментов сбкратить практически,до одной стадии, получая индивидуальный белок; сорбенты стойки, стабильны в диапазоне рН от 6 до 11 при температуре от 0 до 50 С, гидрофильны, имеют большую удельную поверхность, механически .прочны, имеют однородную форму. Ввиду легкой: регенерации и возможности длительного хранения синтезированные сорбенты могут быть миогократйо использованы для выделения н очистки индивидуальных белков.

Данные по использованию получен-; ных новых соедииеннй и качестве афинных сорбентов для афинной хроматографии, а также данные -по регенерированию и хранению афинных сорбентов представлены ветабл.З.

977463, о о х а хех ж к

eox

9ÎР ! 91

Х 1

Ф х z

»

1 ж а

Э х

CO Ю \О CO I

ОО Г 1

1.

1 ео

ÐI а ох д»ж ко ох ихж! 1

»» 1 I-»

1 Э

I .Э ж1 а

К1

1

9!

Я» 1

I довеoжж

IÕХОХЕЕ1Д

ОХЕ! ФЭ!К

Оеа0ХО а! О

Х Х а Э !» Х 1-» I Е

r,ооаоко

1*! а о н х ц в 1

Оъ

»» »

1

1 ь

ОО

1 ь ь ю

CO ф CO (О

aO O с ш an

СО

CO с а ь

»О аО

»с»

»п ь в с с с

Ю .т а

ЧЭ т»» CO с с е

»О СО

1 1

1 I 1 I I

I

1

1

1

1

1 I l I I

I о I !

»! l ое ж 1ю хкка! хожа жох э 8 иээа1

Э ZC(WV I

99жIo

Д I» O»III Ф 1 Д нхх а!!к

ОЕ Иеь! O

Оu) ФОИ Е хацхе 1 иоо е

WOrOI»

Ю Ю с с

»О Ь

CO !» с

Ю

»-»

РЪ сп ь г. с с Я

CO O

СО Ch . CO

».О»-1 с

1

1 «1 ж.Х х»л а»!

Э 1 I I» PI !II !» Э

О Ц 00 . а ехжжххдох

О о m ж1К! э

О ж О О 1 6»»3 О 0»О ,каежомиха

090!»ККОох> О

1! сох еоЕоо

1

1

I Д I ! о. ох

1 ОХ

I, х ж

1 Е Е

I I»I Ф

Ю Ю Ю Ю

Ю Г CD an

Сс! г» ь (Ч

»» » ь ч

» .О СО ь ь а

О Ь CO

%.»

1

Р7

СЭ !

""Т

Р» Р»

Р С4

Ь о

I» о ж !» ех

63 Э

I» а хо. е о

Е !

»

Щ а е

Д

1,„

Ж !

" тстав х

Ж

Д уб .стет

А > к Фа н ж е» ох оа х о

Я .!» х х

Rod. оа х о ое х 5

9 !

» х о е о о

f а до

1Х I

1 а 1»1»»

N 4 I !!!»о l

Э CO 9 и !!! 1 а

К 1- » 1 ох 1о! е жибао ихаа » д

Э Э 1 1

Х Х ЭЦЮ 1 О е»oах ааее 1 х

НХЕН 1 Е

Ю 11 "!»! СО Ю

CO СО СО 00 CO !.- CO

»»»»Ф с с

СО»О»"» Ь»Ч»О

О I I CO О»О л а ь (О СО (О ОО СО CO CO атзХ ,., ь ц р» д и Ь Р, я а 4

11 (—

X1 о$ о хоаау

Яж В»

R .! д ттсссl 1 к

„а о хд х эк

Х 9 щ кс, х о "ж

О, 9 »0

ХО!

Кх!О ж М»».

I O

Э I»l

o Ф х х ц

jRI

oo х О, r5

ze э е ж о

Ц !

Ф»»4 к ж н э

»»! а х чэ!

Э 9!О о ст

977463

Формула изобретения формулы

Р-МН g — О < Нг

-О р щ ) — О СНИ ю

35

Составитель Г.Коннова

Техред И.Гайду; Корректор Г.Огар редактор С.Юско

9110/30 Тираж 388 Поддисное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва,. Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул. Проектная, 4

Заказ

1. Иммобилизованные на полимерной матрице р — и, у-амидные производные нуклеозид-5 -ди- или трифосфатов

Ьбщей формулы 5 где и - 2 или 3;

R — полимерная матрица; 15

Х вЂ” Н или ОН;

A — природное основание, s качестве сорбентов для афинной хроматографии.

2. Способ получения иммобилизованных на полимерной матрице - и, . -амидных производных нуклеозид-5

-ди- или трифосфатов общей формулы

1 где п = 2 или 3>

R — полимерная матрица;

Х вЂ” Н или ОН;

А — природное основание, отличающийся тем, что нуклеозид-5 -ди- или триФосфат общей

1 где и, Х и А — приведенные выше эначения, подвергают взаимодействию с 10-15-кратным избытком карбодиимида в водной среде при рН 5-6 и 10-15 С с добавлением в реакционную смесь полимерной матрицы, сапержащей свободные аминогруппы.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

Trayer I.P., Trayer R. Affinicy Chromatography of Nicotinamid NucIeotide-Dependent Dehydrogenases on

ImmobiIized NucIeotide Derivatives

QiochemicaI JournaI, 1974, 141, 775779.

Карщауег EI., Lappi D.A., KapIan N.0. The synthesisi of 8-(6-aminohexy)-amino-СТР and GDP and their

appIication as Ligands in аН1п1т>

chromatography. - AnaIyticaI Biochem., 1979, 99, 189-199.

3. Labow R.S., Layne D.S, The

formation of GIucosides of ?эоНаvones and of some other phenoIs by .Rabbit Liver MicrosomaI Fraction

BiochemicaI JournaI, 1972, 28.491-498, 4. Иммобилизованные ферМенты.

Под ред. И.B.Березина, т.1, N., 1976, с. 170-171.