Способ определения чувствительности бактерий к бактериофагу

Способ определения чувствительности бактерий к бактериофагу

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

(11)

ИЗО6РЕТЕН ИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Союз Советских

Социалистических

Республик (61) Дополнительное к авт. свид-ву— (22) Заявлено 26.10.79 (21) 2832624/28-13 с присоединением заявки №вЂ” (51) М. Кл.з

С 12 N 1/00

С 12 N 7/00

Гоеударственнык комнтет (23) Приоритет—

СССР

Опубликовано 30.11.82. Бюллетень № 44

Дата опубликования описания 05.12.82 (53) УДК 576.858..9 (088.8) ло делам нзобретеннй н открытий (72) Авторы изобретения

Н. В. Гриц, К. М. Белявский, А. Ф. Былинский и 1О. К. Фомичев

Белорусский ордена Трудового Красного Знамени государственный университет им. В. И. Ленина (71) Заявитель (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ

БАКТЕРИЙ К БАКТЕРИОФАГУ

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано в микробиологической промышленности, ветеринарии при определении чувствительности бактериальных культур к бактериофагам.

Известен способ определения чувствительности бактерий к бактериофагу. О чувствительности бактериальных культур к бактериофагу судят по образованию зон лизиса в местах пересечения полос нанесенной на плотную питательную среду суспензии бактериофага - полосами нанесенной суспензии бактериальных клеток 11).

Недостатком способа является его трудоемкость.

Известен способ определения чувствительности бактерий к бактериофагу путем нанесения бактериальных проб на полужидкую питательную среду, содержащую бактериофаг, и учета зон лизиса после инкубации (2).

Известный способ имеет низкую достоверность, так как при нанесении проб бактерий, обладающих эписомами, методом реплик способ дает отрицательные результаты при работе с чувствительными к фагу бактериальными культурами.

Цель изобретения — повышение достоверности определения.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу определения чувствительности бактерий к бактериофагу путем нане5 сения бактериальных проб на полужидкую питательную среду, содержащую бактериофаг, и учета зон лизиса после инкубации, в питательную среду дополнительно вводят клетки чувствительной к бактериофагу кульTYPb

Способ наиболее целесообразно применять при определении чувствительности бактерий, обладающих половыми эписомами, к специфическому бактериофагу особенно при использовании метода реплик для нанесения изучаемых бактериальных культур на поверхность питательной среды с фагом.

На чертеже (А и Б) даны чашки с содержанием эписом у бактерий.

Ниже приведены примеры реализации способа.

Пример I. Исследуемые на содержание эписом бактериальные штаммы засеваются в количестве 150 — 200 на матричную чашку с плотной питательной средой, инкубируются в течение 4 — 6 ч при оптималь977488

Исходная концентрация фага (частицы/мл) Добавление в полужидкую

Конечная конРезультаты определения чувствицентрация фага после инкубации (частицы/мл) среду тельности культуры к фагу (наличия половых зписом) 10

10"

1 08

1 ОВ

109

10в

10п

10

10 ной для их роста температуре и реплицируются на чашку с двуслойным агаром, в верхнем полужидком слое которого содержится

10 частиц специфического фага и 10 клеток штамма, несущего эписому, детерминирующую чувствительность к данному специфическому фагу. Идентификацию содержащих эписомы штаммов производят на основании способности к формированию зон роста на поверхности двуслойного агара: не содержащие эписом, устойчивые к фагу штаммы образуют отчетливо выраженные

10 зоны роста, тогда как содержащие эписому штаммы зон роста не формируют. Присутствие в полужидком слое агара клеток, обладающих эписомой, повышает лизирующую способность фага по отношению к чувствительнымм шта м ма м.

Пример 2. Установлено, что повышение лизирующей способности фага связано не только с повышением его титра в присутствии клеток чувствительной к нему культуры. За время инкубации титр фага увеличивается лишь в 5 — 10 раз и достигает максимально 10 частиц/мл. Внесение в полужидкий слой указанного числа фаговых частиц не дает положительных результатов в отсутствии чувствительной бактериальной

25 культуры, тогда как использование фага в меньших титрах (даже 10 частиц/мл) совместно с чувствительной культурой позволяет получать четкие результаты (наличие зон лизиса).

Предлагаемым способом можно преиму- з0 щественно определять наличие в бактериях половых эписом (F-фактора и его производфаг без клеток чувствительной к нему культуры

Фаг с клетками чувствительной к нему культуры ных), детерминирующих образование на поверхности клетки половых ворсинок, являющихся местом адсорбции специфического фага.

Чувствительность метода максимальна при использовании 0,5%-ного агара и снижается в случае использования более плотной среды. Предлагаемая консистенция верхнего слоя обеспечивает максимальную диффузию фаговых частиц, высвобождающихся в процессе лизиса чувствительных клеток газона, что, в свою очередь, создает оптимальные условия взаимодействия фага с проверяемыми культурами.

Процесс реплицирования на чувствительность метода не влияет, а предлагается как наиболее удобный, доступный и наименее трудоемкий прием. Определение фагочувствительности содержащих эписомы бактерий можно осуществлять и путем нанесения на поверхность 0,5%-ного агара с фагом и чувствительной культурой жидких суспензий (аппликатором или даже вручную) .

Оптимальное содержание чувствительных бактериальных клеток в полужидком агаре не менее 10 клеток/мл.

В таблице приведены результаты определения чувствительности бактериальных культур, обладающих эписомами, к специфическому фагу.

Сравнение результатов определения чувствительности бактериальных культур, обладающих эписомами, к специфическому бактериофагу при использовании известного (2) и предлагаемого способов.

977488

Формула изобретения

Составитель Л. Серова

Редактор А. Фролова Техред И. Верее Корректор Е. Рошко

Заказ 9117/32 Тираж 505 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж вЂ” 35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП «Патент», г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Данные, приведенные в таблице, свидетельствуют о значительно большеи достоверности предлагаемого способа определения чувствительности бактериальных культур к бактериофагу: при введении в полужидкую среду частиц бактериофага даже в концентрации 10 частиц/мл известный способ не позволяет установить чувствительность культуры к фагу, в то время как при совместном введении в полужидкую среду лишь 10 частиц фага/мл совместно с 10 чувствительных к нему клеток/мл получают положительные результаты о наличии чувствительности культуры к фагу, даже несмотря на то, что к концу опыта концентрация фаговых частиц в полужидкой среде составляет лишь 10 частиц/мл.

Пример 3. Проводят идентификацию отдельных клонов штаммов Escher ichià col i

К-12: штамма HfrH, содержащего интегрированную в хромосоме F-эписому, штамма

АВ 1157, лишенного эписомы, и штамма J62, содержащего эписому F1ac в автономном от хромосомы состоянии.

На чашку Петри с мясо-; 1,5%ным агаром последовательно засевают !50 отдельных изолированных колоний указанных штаммов и иньлоирхют при 3 С в течение 4 ч до появления отчетливо выраженных зон роста (фиг. А).

Выросшие колонии реплицируют на чашку с двуслойным агаром, которую готовят следующим образом: в чашку Петри вносят

30 мл расплавленного мясо-пептонного 1,5% 3Q агара; через 1 ч на поверхность затвердевшей среды наслаивают расплавленный и охлажденный до 45 С полужидкий (0,5%-ный) агар в объеме 3 мл, в который перед наслаиванием вносят 0,5 мл фага 0,6 с титром

10 частиц/мл и 0,1 мл чувствительной к указанному фагу культуры штамма HfrH c титром 10 клеток/мл. Состав полужидкого агара %: пептон 1,5; триптон 0,8; хлористый натрий 0,3; глюкоза 0,1 и агар-агар 0,5.

После реплицирования чашку с двуслойным агаром выдерживают при 37 С. Через

18 — 20 ч эту чашку (фиг. Б) сравнивают с исходной (фиг. А) .

Как видно из фигуры. клетки содержащих эписомы штаммов HfrH (1) и J 62 (3) после реплицирования не формируют зон роста, так как подвержены литическому действию фага QP. Не содержащие эписом клетки штамма АВ 1157 (2), устойчивые к фагу, формируют отчетливые зоны роста.

Способ определения чувствительности бактерий к бактериофагу путем нанесения ба териальных проб на полужидкую питатечьную среду, содержащую бактериофаг, и учета зон лизиса после инкубации, отличаюtquucя тем, что, с целью повышения достоверности, в питательную среду дополнительно вводят клетки чувствительной к бактериофаГХ КУЧЬтх РЫ

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Миллер Дж. Эксперименты в молекулярной генетике. М., «Мир», 1976, с. 94 — 95.

2. Адамс Марк. Бактериофаги. М., Издво иностранной литературы, 1961, с. 15 (прототип) .