Способ получения олигодезокситионуклеотидов

Способ получения олигодезокситионуклеотидов

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ -979361

Союз Советския

Социалистических

Республик

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (61) Дополнительное к аат. санд-ау (22) Заявлено 30.04.81(21) 3285636/23-04 (И)М.КВ.з с присоединением заявки HP (23) ПриоритетС 07 Н 21/04

G 01 N 33/68

Государственный комитет

СССР по делам изобретений и открытий 33)УДК 547.454 (0ss.s) Опубликовано 07,1282 . Ьоллетень HP 45

Дата опубликования описания 07.12. 52

"I ! .l

)

Институт цитологии и генетики Снбирского" отделения AH СССР а, (72) Авторы изобретения

В.П.Кумарев, В.С.Богачев и В.H.Ðûáàêîé (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ОЛИГОДЕЗОКСИТИОНУКЛЕОТИДОВ

0 0

0 5

10

OR

25

Изобретение относится к усовершенствованному способу получения олигодезокситионуклеотидов общей формулы

НО где В - тимин, аденин, гуанин, цитозин; и 1-14;

R — водород или остаток фосфотиоата.

Олигодезокситионуклеотиды формулы (3) являются биологически актирными соединениями и используются в качестве матриц в PHK-полимераэной системе Е.Сок1.

Известен способ получения олигодезокситионуклеотидов формулы (!), .заключающийся в последовательной обработке литиевой соли 2 -дезокси-Nацилнуклеозид (или олиготионуклеотидил)-3 -фосфотиоатов мономером — лиI тиевой солью 2,5 -дидезокси-N-ацил5 -йоднуклеоэид-3 -S-P-N,N-дифенилкарбамонл-(или циан)этилфосфотиоатов или 2,5 -дидезокси-N-ацил-5 -йоднук1 леоэидами в водном диметнлформамиде (ДИФА) в осаждении продукта ацетоном,.осадок отделяют центрифугирова нием, в обработке его щелочью, в экстракции щелочного раствора толуолом с последующей нейтрализацией катионообменной смолой, в Н+ -форме, во взаимодействии полученного продукта со следующим мономером, в обработке, в случае необходимости, концентрироваиньм аммиаком H в выделении катионообменной хроматографией для получения целевого продукта, где R - водород. Додекадезокситионуклеотид состава d(GTCCAT7) получен с выходами 86-95% на стадию, длительность реакции на одной стадии

2,1 ч, длительность раСтворения реагентов 3,5 ч, средняя длйтельность стадии 9,6 ч. Длительность. первой стадии 3 ч, десятой — 14 ч, что связано с сильныч замедлением реакции

979361 и ухудшением растворимости реагентов в ДМФА g 1 ).

Недостатками этого способа являются низкая скорость взаимодействия реагентов, обусловленная недостаточно высокой реакционной способ- 5 ностью применяемых литиевых солей мономеров как йод-, так и фосфотиоатсодержащих; значительное замедление скорости реакции и связанное с этим увеличение затрат времени на одну стадию по мере увеличения длины синтезируемого продукта; наличие воды в реакционной среде, приводящее также к уменьшению скорости реакции; плохая растворимость литиевых солей реагентов в диметилформамиде, вызывающая большие затраты времени на их растворение (необходимость перемешивания усложняет синтез); необходимость экстракции щелочного раствора толуолом для удаления дифенилакриламида; неоправданно сложное проведение ряда операций, а именно выделение осадка продукта центрифугированием и удаление воды лиофильной сушкой, что усложняет процесс.

Целью изобретения является сокращение затрат времени при синтезе олигодезокситионуклеотидов и упрощение процесса.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения олигодезокситионуклеотидов формулы (1), заключающемуся в том, что проводят последовательную обработку тетрабутиламмонийной соли 2 -дезокси-NI ацилнуклеозид (или олиготионуклеотидил)-3 -фосфотиоата внутренней солью 2,5 -дидезокси-N-ацил-5 -йоднуклеI (I озид-3 -S-P-jN3 п-диэтилметиламино) 40 фенил)карбамоилэтилфосфотиоата общей формулы сН

Е гС2Н5 а ОЭ 2П5 45

Стадия 1. 2 -Дезокси-N<-анизоилцитидин-3 -фосфотиоат, ди (B N ) -соль

Г 4-(18Г8 мг; 0,02 ммоль) и 2,5 -дидезокси-5 -йод-N4-анизоилцитидин-35О -S-P-PN-(n-диэтилметиламино)фенил карбамоилэтилфосфотиоат (19 мг;

0,024 ммоль) растворяют в безводном .диметилформамиде (0,6 мл) и выдерживают 2 мин. Затем смесь об55 рабатывают 0,05 М раствором йодистого лития в ацетоне (20 мл), осадок отфильтровывают, промывают ацетоном (2 5 мл), сушат в вакууме 10 мин.

Осадок растворяют в 1 М LiOH (2,0 мл), 60 выдерживают 25 мин и наносят на колонку, содержащую в нижней части дауэкс 50 в Bu4N"ôoðìå (1 мл), а в верхней - дауэкс 50 в пиридиниевой форме (3 мл). Смолу элюируют водой (ГО мл), элюат продукта упаривают о о

° 0 5-С Н -С

0 где B — тимин, N4-анизоилцитозин,.

N -бензоиладенин, N -изобу 2. тирилгуанин, реакцию осуГцествляют в безводном

ДМФА, продукт реакции осаждают раствором йодистого лития в ацетоне, (осадок фильтруют), осадок обрабатывают щелочью, нейтрализацию щелочного гидролизата продукта проводят путем пропускания через колонку, содержащую в верхней части катионообменную смолу в пиридиниевой форме, а в нижней части — в тетрабутиламмониевой форме.

Полученный продукт подвергают взаимодействию со следующим мономером, обрабатывают, в случае необходимости, концентрированным аммиаком, и выделяют катионообменной хроматографией для получения целевого продукта, где R - водород. Схема реакции го

Ф +

ОФ 4-В2 где  — тимин, N -анизоилцитозин, N -бензоиладенин, N -изобу2 тирилгуанин;

R — Н, остаток фосфотиоатов;

R — - Н, олигодезокситионуклеотидил/ Фо

R2-С Н С-NH-С Н -Б (С Н ) СН

К -(Н С Н ) N+ °

4 94

Средняя длительность реакции 0,08ч, средняя длительность одной стадии

1,3 ч.

Пример 1 2 -Дезокси-1цитидилил(3- 5)-5 -дезокси-5-тио(цитидилилг I (3 5 ) -аденилил-(5 ) -тимидилил.Г Г (3 - 5 )-дицитидилил-(3- 5 )-тритимидилил-(3 5 )-дицитидилил-(3 5Г )— аденилил-(3 - 5 ) -тритимидилил-(3- 5Г ) гуанозин . 2 -Дезокси ((Сря) ApsTps (Cps)z Aps(Tps) G)V.

979361 досуха и используют далее, не очищая, на второй стадии.

Синтез на последующих стадиях

2-15 проводят аналогично стадии 1.

Загрузка исходных веществ и время реакции приведены в таблице °

На пятнадцатой стадии продукт, после осаждения ацетоном, растворяют в 10 мл концентрированного раствора аммиака в воде (осч), выдерживают 6 ч при 50 С, упаривают аммиак и наносят на колонку с амино хромом С-80 -(75 cM ). Элюируют

0,08 М К Н Р04, рН 6,5 (0,5 л), в

9 М мочевине, затем линейным градиентом 0,08+0,11 K Н Р04 в 9 М мочевине (рН 6,5), объем смесителя и резервуара по 1 л, скорость элюации 90 мл/ч. Продукт выходит при

0,105 N КН P04 . Соответствующие ему фракции промеряют на спектрофотометре, объединяют, разбавляют в

2 раза водой и наносят на 1 мл аминохрома С-300. Промывают водой, 0,20,4 М бикарбонатом аммония (40 мл), рН 7,0 и затем элюируют продукт 3 мл

1 М бикарбоната аммония (рН 8,5) .

Раствор упаривают в вакууме и водный раствор окончательно очищают на колонке с сефадексом G-10 (100 мл), элюируя продукт водой. Фракции, соответствующие пику продукта, пропускают через катионит челекс (Naформа, 1 мл), упаривают и растворяют в 0,3 мл воды. К этому раствору прибавляют ацетон (10 мл), осадок продукта центрифугируют, сушат в вакууме и получают 17 мг (16% в расчете на исходный мономер) пентадека натриевой соли (и) . Структуру продукта подтверждают модифицированным методом Сэнжера, подвергая электрофорезу на ацетате целлюлозе его фосфодиэстерозный гидролизат, с последующей гомохроматографией на ТЭАЭ-целлюло.зе при .30 и в присутствии меркаптоэтанола, идентификация пятен гомохроматограммы дает структуру

С-С-A-T-С-С-Т вЂ” Т-Т-С-С-A-T-T-T-О.

Пример 2. 2-Дезокси(цитидилил-(3 - 5 ) -5 -дезокси-5 -тиоцити-! дин)-3 -фосфотиоат, 2 -дезокси-N<-аниэоилцитидин-3-фосфотиоат, ди-(Bn4N )+ соль (18,8 мг; 0,02 ммоль) и 2,5>— дидезокси-N<-анизоил-5 -йодцитидин3 -S-fb-$N-(n-диэтилметиламино) фенил)карбамоилэтилфосфотиоат (19 мг, 0,024 ммоль) растворяют в безводном диметилформамиде (0,6 мл) и выдерживают 2 мин. (20 мл), осадок отфильтровывают, промывают ацетоном (2 5 мл), сушат в вакууме 10 мин.

Осадок растворяют в концентрированном аммиаке, выдерживают 6 ч при

50 С, упаривают досуха и наносят раствор в 0,1 М бикарбонате аммония, рН 7 » в 10%-ном спирте (1 мл) на колонку, содержащую 200 мл сефадекса G = 25 суперфайн в.том же буфере при 5 С. Элюцию проводят тем же буфером со скоростью 5 мл/ч. Фракции, соответствующие пику продукта, объе10 диняют, упаривают в вакууме, затем трижды с 70%-ным спиртом, водный раствор пропускают через катионит челекс (Na-форма), упаривают досуха и раствор в МеОН (0,3 мл) выли35 вают в эфир (20 мл), осадок отфильтровывают и получают 0,065 г (94%) тринатриевой соли (П). Вещество гомогенно при ионообменной и гельхроматографии, а также при тех на силуфоле в системе хлороформ — метанол- 1 М ацетат аммония (рН 6, 5) (10:20:2 ч/v)

УФ-максимум в воде 272 нм (Я=18200); уФ-минимум 248 нм (= 12000), содержание тиофосфатных групп 99% по данным йодометрического титрования, что подтверждает структуру,) .

Ю

Использование предлагаемого способа получения олигодезокситионуклеотидов обеспечивает по сравнению с известными следующие преимущества: сокращение длительности одной стадии в среднем с 9,6 до 1,3 ч или в 7,4 раза за счет увеличения скорости взаимодействия реагентов в среднем в 25 раз — 2 ч экономии; уве35 личение скорости растворения реа гентов в среднем í 100 раз - 3,5 ч экономии; исключение экстракций толуолом и фильтрование катионообменной смолы — 0,3 ч экономии; замена

4(центрифугирования и лиофильной сушки на менее длительные и более простые фильтрование и упаривание на ротационном испарителе — 2,5 ч экономии;

4 упрощение процесса, заключающееся в исключении механического перемешивания при растворении реагентов за счет применения хорошо растворимых солей последних; упрощении операции щелочного гидролиза за счет применения для нейтрализации щелочи избытка катионита в пиридиниевой форме и проведения ее в колоночном режиме.

Скорость взаимодействия реагентов в предлагаемом способе увеличивается в 10 раз по сравнению с начальной стадией прототипа, но вследствие существенного замедления ее на конеч60 ных стадиях в последнем скорость реакции увеличивается в среднем в 25 раз.

979361

Длительность реакции, мин

Стадии

Реагирующие вещества.

АН с Аи е

dCps.(Bu N+) (20) + IdCpsR< (24) Продукт .стадии

Вт;М

+ IdApsR+< (28) + IdTpsR< (24) Аи +

+ IdCps+. (24) + 16Срзй (25)

+ IdTps+ (24)

+ IdTpsR + (26) 10

+ IdTpsR (26)

+ ?йТрз1 (27) 12

12

+ ТйТрзК (28) 1 вц4ЕМ

+ IdG (40) 14

14 к е

2,5 -Дидезокси-5 -йод-N -бензоиладенозин-3 -S-+(N-(n) С диэтилметиламино) фенил)карбамоилэтилфосфотиоат.

%%

2, 5 -Дидеэокси-5 -йод-тимидин-3 -S-)Ъ-(И-(n-диэтилметилI f амино)фенил)карбамоилэтиуфосфотиоат. . 2,5 -Дидезокси-5 йод-N -изобутирилгуанозин, нуклеотидов общей Формулы

" Ф

О О о» 5

Формула изобретения

Способ получения олигодеэокситио+ IdTpsR (26) АИ

+ IdCpsR + (26) An +

+ IdCpsR< (26) 5z

+ ЫАрэВ (30) -где  — тимин, бдении, гуанин, цитозин1

n = 1-14;

R — водород, остаток фосфотиоата, заключающийся в последовательной обработке соли 2-дезокси-N-ацилI нуклеозид (или олиготионуклеотидил)—

-3-Фосфотиоата мономером в диметилформамиде, в осаждении продукта, в обработке его щелочью с последующей

4© нейтрализацией щелочного гидролиза катионообменной смолой, во взаимодействии полученного продукта co.. следующим мономером,.в обработке, в случае необходимости, концентриро6$ ванным аммиаком и выделении катионо9 979361 10 обменной хроматографией для получения где В - тимин, Н анизоилцитоэин, целевого продукта, где R - водород, N-бенэоиладенин, N -изобуотличающийся тем, что,. тирилгуанин, с целью сокращения длительности про- реакцию проводят в безводном дицесса и его упрощения, в качестве

l метилформаииде продукт реакции осаж соли 2-дезокси-N-ацилнуклеозид(или . 5 дают раствором йодистого лития в олиготионуклеотидил)-3-фосфотиоата ацетоне, а нейтрализацию щелочного используют их тетрабутиламмонийную гидролиэата продукта проводят путем соль, в качестве.мономера приме- пропускания через. колонку, соцержащую няют внутреннюю соль 2 Д5 -дидеэоксив верхней части катионообменную смо.-N-.à èë-5-йоднуклеоэид-3- S-p EN (n- !О лу в пиридиниевой форме, а в нижней дизтилметиламино)фенил)карбамоил- части — в тетрабутиламмонийной фор- этилфосфотиоата общей формулы ме.

em 3 к еуг 255

Источники информации, 2Нб принятые во внимание при экспертизе

О

Ю О

МН

2 +

1. Авторское свидетельство СССР по заявке Р 2798760/04, кл. С 07 Н 19/06, 1979 (прототип).

Составитель Л.Никулина

Редактор М.Петрова ТехредМ.Гергель Корректор В. Прохненко

Эаказ 9270/2 Тираж 388 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП Патент, r. ужгород, ул. Проектная, 4