Способ получения сорбента для афинной хроматографии

Способ получения сорбента для афинной хроматографии

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

gs>979364

Союз Советскии

Социалистических

Республик (61) Дополнительное к авт. саид-ву(22) Заявлено 31.03. 81 (21) 3303955/23-05

Р М з

С 08 В 37/12

G 01 N 31/08 с присоединением заявки М

Государственный комитет

СССР по делам изобретений н открытнй (23) Приоритет (Опубликовано 0 7123 2, Бюллетень М45.

Дата опубликования описания 071282

{ЗЗ) УДК543. 544..42(088.8) A.A. Терентьев, lO.Ñ. Татаринов, С.К. Кр оносов;--...

И.Е. Малахов, Б.A. Кульнев, С.П. Фещенк

А.К. Тагирова и Е.Г. Соломко

/ -тм с

2-й Московский ордена Ленина государст нный:.. медицинский институт им. Н.И. Пирогова (72) Авторы изобретения (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ COPBEHTA ДЛЯ АФИННОИ

ХРОМАТОГРАФИИ

Изобретение относится к биологической химии, в частности к препаративной и технологической биохимии, и может быть использовано для получения и фракционирования белков крови человека и животных, различных ферментов к антигенно обособленных белков, появляющихся в крови онкологических больных, например альфа-фетовротеина и трофобластспецифического бета-глобулина.

Известен способ получения сорбента для афинной хроматографии взаимодействием сефарозы с веществом формулы

В1

=0 ХК Q В2

20 мн ф-зы1О >

$0 0Ма $0 02И Е1 где К,(— Н или SO ONa, R> — $0 ONa или И в присутствии хлорида и карбоната натрия. Используют 11 вес.Ъ раствора хлорида натрия, затем проводят термическую обработку при. 80-85 C j 1 j.

Однако, несмотря на широкое применение полученной по этому способу так называемой "голубой сефарозы" в препаративной биохимии, этому сорбенту присущ крупный недостаток: стерические помехи, создающие затруднения для аффинного взаимодействия данного сорбента с некоторыми белками. В частности, он имеет малую емкость по отношению к альфа-фотопротеину (20 мкг/мл) и трофобластспецифическому бета-глобулину (15 мкг/мл).

Целью изобретения является увеличение емкости сорбента по отношению к альфа-фотопротеину и трофобластспецифическому бета-глобулину.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения сорбента для афинной хроматографии к

100 вес.ч..сефарозы добавляют 80-

100 вес.ч. раствора трихлортриазина в безводном ацетоне, содержащего

1-3 вес.в трихлортриазина, перемешивают 10-15 мин при рН 8,0-8,5, отмывают последовательно водным раствором ацетона и дистиллированной водой, добавляют 50 вес.ч. водного раствора, содержащего по 2-3 вес.Ъ гептаметилендиамина и бикарбоната натрия, перемешивают 2-10 ч при ком

979364

SO оюа Rg лн О к2

0 ЭГ O й11 О

)Огра МН-(« j;ÊÍ Î ГОН

Мс Я

3 натной теМпературе, отмывают дистилированной водой, затем осуществляют взаимодействие полученного продукта с 2 вес.ч. вещества формулы (I) в присутствии 10 вес.ч. хлорида натрия и 2 вес.ч. карбоната натрия, тща- 5 тельно перемешивают и подвергают обработке при 55 С 10 ч.

Вещество укаэанной формулы называется цибакрон синим красителем.

Сорбент предназначен для аффинной tO хроматографии альфа-фетопротеина и трофобластспецифического бета-глобулина, помимо этОго сорбент мажет быть использован для аффинной хроматографии тех белков, которые аффинны 35 к "голубой сефарозе".

Полученный, продукт представляет собой мелкогранулированный гель сефарозы ярко-голубого цвета, обладающий хорошими механическими и фильтрующи0 ЗН

Il где R - Н, . SO ONa, R — SO ONa, Н, R - сефароза, выбранная из груп-35 пы комерческих препаратов, например сефарозы 2В, сефароза СЬ 2В, сефароза 4В, . сефароза CL 4В, сефароза

6В, сефароза CL 68. 4р

В результате синтеза сначала получается дихлортриазиновое производное сефарозы, в котором оба атома хлора весьма активны в щелочной среде, поэтому реакцию проводят в избытке три- 45 хлортриаэина в течение короткого промежутка времени — 10-15 мин 1избыток трихяортриазина необходим, чтобы связать все активные гидроксильные группировки сефарозы, а короткий промежуток времени, чтобы не успеть отгидролизовать лишние атомы хлора ).

Коньюгация дихлортриаэинового производного сефарозы с гептаметилендиамином проводится в присутствии би арбоната натрия, что обеспечивает необходимую щелочную буферную емкость среды. Избыток гептаметилендиамина и длительность процедуры коньюгации (2-10 ч) обеспечивают полноту связывания и отгидролиэовывание третьего 60 (последнего) атома хлора. Полученное . производное сефарозы не содержит активных (стерически доступных ) гидроксильных групп, они все блокированы триазином и содержат только активные g5 ми свойствами, поэтому его можно использовать в колоночной хроматографии. Он выдерживает максимальное давление без нарушения фильтрующих способностей от 50 см вод. ст. для сорбента, синтезированного на основе сефарозы 2В, до 150 см вод. ст. для сорбента, синтезированного на базе сефарозы СЬ 6В. Количество связанного в сорбенте красителя, определяющееся путем гидролиза 1 мл сорбента в 0,1 М НС1 в течение 10 мин при 90 С с последующей спектрофотометрией при 610 нм, колеблется от

0,85 мг цибакрона синего на 1 мл сорбента, синтезированного на базе сефарозы CL 2В, до 1,52 мг красителя на 1 мл сорбента, синтезированного на основе сефарозы 6В.

Полученный сорбент может быть изображен в виде формулы, аминогруппы, которые могуr участвовать в дальнейших реакциях. На этом этапе синтеза полученное нами производное сефарозы с введенными в нее аминогруппами реагирует в присутствии карбоната натрия с цибакрон синим красителем. Цибакрон .синий краситель является производным трихлортриазина, в котором два атома хлора уже замещены, а один атом хлора остается реакциойноспособным и может реагировать со свободными (не ароматическими ) аминогруппами. Так как это последний иэ атомов хлора молекулы трихлортриазина, он менее реакционноспособен и для реакции необходим рН около 10-11 и повышенная. температура (45 C и выше) . В данном случае реакция может идти только по свободной аминогруппе проиэводного сефароэы и хлору цибакрон синего красителя, в результате чего получается описанный сорбент.

Концентрация раствора трихлортриаэина не должна превышать ЗЪ, потому что трихлортриаэин плохо растворим в водных растворах ацетона и его избыток выпадет в осадок, а при добавлении раствора трихлортриаэина в безводном ацетоне к суспенэии сефарозы ацетон обводняется. Концентрация гептаметилендиамина более 3% нежелательна из-за слишком большого повышения рН среды (за 11 ) и наступающего вслед979364 ствие этого щелочного гидропиза сефароэы и ухудшения ее фильтрующих и механических свойств.

Уменьшение концентрации трихлортриазина (меньше 1% ) может привести к неполной блокаде всех реакционноспособных гидроксильных групп сефарозы и тем самым последующее присоединение цибакрон синего красителя может произойти по этим группам.

Уменьшение концентрации гептаметилендиамина приводит к существенноI му понижению емкости получаемого сорбента (примерно в 4-5 раз), в то время как концентрация бикарбоната натрия может быть понижена до 0,5Ъ, а увеличена быть не может из-эа плохой его растворимости в данной среде.

Хлорид натрия добавляют для того, чтобы избежать расплавления сефарозы, поэтому снижение концентрации нецелесообразно иэ-за ухудшения фильтрующих свойств сорбента, а увеличение затруднительно, так как при данных условиях он не растворяется полностью. Повышение концентрации карбоната натрия при температуре

55ОС приводит к ухудшению фильтрующих свойств сорбента вследствие частичного щелочного гидролиза сефароэы и ее расплавления в связи с этим, уменьшение же концентрации карбоната натрия в смеси (меньше одной части) приводит к уменьшению емкости сорбента примерно в 2 раза. Так как реакционная способность аминогрупп довольно высока, то тепловую обработку вполне можно приводить

° при 45 С, но в течение 10 ч или при

55О С в течение 5 ч. Проведение коньюгации по наименьшим значениям признаков способа (концентрация, время, температура), которые приведены выше, дает воэможность получить сорбент, емкость которого в 4-5 раэ меньше, чем у получающихся в приведенных примерах.

Пример 1. Сорбент общей формулы (I I), где R> — сефароза 4В, представляющий собой мелкогранулированный гель. сефарозы ярко-голубого цвета, выдерживающий беэ нарушения .фильтрующих способностей 120 см вод. ст. и содержаший на 1 мл геля

1,41 мг цибакрон синего красителя, приготовляется следующим образом. К

100 r геля сефарозы 4В добавляют

100 мл ацетона, содержащего 2 г трихлортриазина, смесь ставят на магнитную мешалку и перемешивают, добавляя по каплям 1 М раствор едкого натра, чтобы поддерживать рН

8,0 ° Такое титрование продолжается

5 мин, пока рН раствора не установится на 8,0 и не перестанет снижаться, далее выдерживают при перемешивании

t5 еще 5 мин и сефарозу отмывают последовательно 2 л 50%-ного водного ацетона и 2 л дистиллированной воды на бюхнеровской воронке. После отмывания сефарозу переносят в химический стакан, добавляют раствор в количестве 50 мл, в котором предварительно растворяют по 3 r бикарбоната натрия и гептаметилендиамина, и ставят на магнитную мешалку на 2 ч, после чего полученное производное сефарозы отмывают на бюхнеровской воронке

2 л дистиллированной воды. Затем гель сефарозы переносят в химический стакан, добавляют к нему 2 r цибакрон синего красителя в порошке, 10 r хлористого натрия, тщательно перемешивают, добавляют 2 г карбоната натрия, еще раз тщательно перемешивают и ставят в суховоэдушный тер20 мостат при 55 С на 10 ч. Полученный сорбент тщательно отмывают на бюхнеровской воронке дистиллированной во" дой до полного обесцвечивания промывной воды. В экспериментах по аффинной

25 хроматограции данный сорбент помимо альбумина и некоторых других сыворо» точных белков при пропускании через него сыворотки плода человека обратимо связывает альфа-фотопротеин, а

30 при пропускании через него сыворотки крови беременной женщины обратимо связывает трофобластспецифический бета-глобулин.

Пример 2. Сорбент общей форЗ5 мулы (II), где R> — сефароза 2В, представляющий собой мелкогранулированный гель сефарозы ярко-голубого цвета, выдерживающий без нарушения фильтрующих способностей давление в

40 50 см вод. ст. и содержащий на

1 мл геля 0,89 мг цибакрона синего, приготавляется следующим образом.

К 100 r геля сефарозы 2В добавляют

100 мл ацетона, содержащего 1 г трихлортриаэина, далее продолжают по примеру 1, а коньюгацию с гептаметилендиаминрм проводят в течение 10 ч.

Полученный сорбент в экспериментах по аффиной хроматографии связывает альфа-фетопротеин. и трофобластспе-.

50 цифический бета-глобулин, как и сорбент, описанный в примере 1.

Пример 3. Сорбент общей формулы (II), где R — сефароза 6В, представляющий собой мелкогранулиро55 ванный гель сефарозы ярко-голубого цвета, выдерживающий без нарушения .фильтрующих способностей давление

130 см вод. ст. и содержащий на 1 мл геля 1,52 мг цибакрон синего краси60 теля, приготовляют следующим -образом.

К 100 г геля сефарозы бВ добавляют

100 мл ацетона, содержащего растворенным в нем 3 г трихлортриазина, далее перемешивают 15 мин, поддерживая рН

65 8,5 добавлением 1 М едкого натра, 979364 и продолжают процедуру по примеру 1.

Полученный сорбент по своей биоспецифичности .аналогичен сорбенту, описанному в примере 1.

Пример 4. Сорбент общей формулы (II), где R y — сефароза CL 28, представляет собой мелкогранулированный гель сефароэы, окрашенный в ярко-голубой цвет, .выдерживающий без нарушения фильтрующих способностей давление в 70 см вод. ст. и содер- 10 жащий на 1 мл геля 0,85 мг цибакроиа синего. Этот сорбент приготовляют следующим образом. К 100 г геля сефарозы. CL 2В добавляют те же вещества, в той же последовательности и в 15 тех же условиях,как в примере 2. Полученный сорбент обладает аффинностью, аналогичной для. сорбента, полученного в примере 1.

Пример 5. Сорбент общей фор- 2О мулы (I13, где Н вЂ” сефароза СL 6В, представлявмций собой мелкогранулированный гель сефарозы, окрашенный в ярко-голубой цвет, выдерживающий без нарушения фильтрующих способностей давление в 150 см вод. ст. и содержащий на 1мл геля 1,43 мг цибакрон синего красителя получают следующим .способом. К 100 г сефарозы CL 6В добавляют равное количество ЗЪ-ного растнора трихлортриазина в безводном ацетоне, перемешивают н течение

15 мин, поддерживая рН 8,5 добавлением по каплям 1 N раствора едкого натра, отмывают водным ацетоном и водой и далее добавляют 50 мл водного раствора, содержащего по 23 гептаметилендиамина и бикарбоната натрия, далее процедуру осуществляют по примеру 1. Полученный сорбент в экспериментах по аффинной хроматс»- 40 графии ведет себя аналогично сорбен,ту, описанному и полученному в примере 1.

Свойства сорбентов, полученных в 45 конкретных примерах следующие. Пример 1 - механические свойстна: выдерживает без нарушения фильтрующих свойств 120 см вод. ст. (давление ), емкость — способен связать 10 мг альбумина; пример 2 — механические свойства: выдерживает без нарушения фильтрующих свойств давление в 50 см врд. ст., емкость — 8 мг альбумина на

1 мл геля пример 3 - механические войства: выдерживает без нарушея фильтрующих способностей давление в 130 см вод. ст., емкость — 12 мг альбумина; пример 4 - механические свойства: способен выдержать без изменения фильтрующих свойств давление 60 в 70 см вод. ст., емкость - 7 мг альбумина; пример 5 - механические свойства: выдерживает без нарушения фильтрующих способностей давление а 150 см вод. ст., емкость — 10 мг 65

1альбумина на 1 мл сорбента. фильтрую щие свойства сравниваются путем определения скорости протекания 0,1 М раствора хлористого натрия через колонки, наполненные сорбектами, как путем свободного протекания, так и под действием перистальтического насоса. В последнем случае отсутствие нарушения фильтрующих свойств констатируется, если скорость протекания

{количество миллилитров за единицу времени ) через колонку с сорбентом совпадает с проспектными данными, характеристическими для данного типа перистальтического насоса.

Емкость предложенного сорбента для альфа-фетопротеина 2-5 мг на миллилитр, для трофобластспецифического бета-глобулина 4-6 мг на миллилитр.

Полученный таким образом сорбент обладает фильтрационными свойствами такими же, как импортный фирменный сорбент "голубая сефароза", не уступая ей по стойкости и стабильности.

Но самое гланное, что этот сорбент имеет новые биоспецифические качества. Он способен адсорбиронать н экспериментах по аффинной хроматографии некоторые новые белки, которые не способен адсорбировать фирменный сорбент "голубая сефароза". Этими белками являются альфа-фетопротеин и трофобластспецифический бета-глобулин, которые известны как раковоэмбриональные белки и используются н ранней диагностике рака, а именно для приготовления иммунодиагностикумов. Сравнивая емкость полученных нами сорбентон с фирменной "голубой сефарозой" по адсорбции сынороточного альбумина человека, получили следующие результаты. На 1 мл сорбента обратимо сорбировалось, "голубая сефароза"

10 мг альбумина, сорбент из примера 110 мг альбумина, сорбент из приМера 2 — 8 мг альбумина, сорбент из примера 3 — 12 мг альбумина, сорбент из примера 4 — 7 мг альбумина и сор бент из примера 5-10 мг альбумина, Таким образом, полученный нами сорбент, обладая хорошими механическими, фильтрующими свойствами и емкостью, не уступающими фирменной "голубой сефарозе", имеет по сравнению с ней преимущества по биоспецифичности и может быть применен н препаративной химии белка для аффинной хроматографии таких раковоэмбриональных белков, как альфа-фетопротеин и трофобластспецифический бета-глобулин.

979364 формула изобретения

Rt

0 „ ЮН Q мнQ m 0 рО,Оыа "

Составитель И. Стояченко

Редактор М. Петрова Техред A. Бабинец Корректор1 В. Прохненко

Заказ 9271/2 Тираж 514 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва. Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Ф

Филиал ППВ "Патент", r. Ужгород, ул. Проектная, 4

Способ получения сорбента для .афинной хроматографии, о т л и ч а юшийся тем, что с целью увеличения емкости сорбента по отношению к альфа-фотопротеину и трофобластспецифическому бета-глобулину, к

100 вес.ч. сефарозы добавляют 80100 вес.ч. раствора трихлортриазина в безводном ацетоне, содержащего 1Ъ

3 вес.Ъ трихлортриазина, перемешивают 10-15 мин при рН 8,0-8,5, отмывают последовательно водным раствором ацетона и дистиллированной водой, добавляют 50 вес.ч. водного раствора,. 15 содержащего по 2-3 вес.Ъ гептаметилен,циамина и бакарбоната натрйя, перемешивают 2.-10 ч при комнатной температуре, отмывают дистиллированной водой,. затем осуществляют вз. имодействие 20 полученного продукта с 2 вес.ч. ьещества формулы (I) где R< - Н или $0 Ойа, R - SO ONa нли Н, в присутствии 10 вес.ч. хлорида натрия и 2 вес.ч. карбоната натрия, тщательно перемешивают в подвергают обработке при 55 С 10 час.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Bohme Н.I и др. Affinity

chromatography of phosphofructokinase vsing Cibacron blu F30-Л "-Journal of сЬллайор арЬу", т. 69, опублик. 1972, с. 209-214 (прототип).