Способ получения иммобилизованного плазминогена

Патент 979508

Авторы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Союз Советския

Социалистическим

Республик (11) 979508 (61) Дополнительное к авт. свид-вувЂ” (22) Заявлено 230780 (21) 2960037/28-13 с присоединением заявки МвЂ” (23) ПриоритетвЂ”

Опубликовано 071282. Бюллетень Йо 45

Дата опубликования описания 07 ° 12.82

f$)) М К 3

С 12 hl 11/06

/ С 12 и 1/80

Государственный комитет

СССР ио делам изобретений и открытий

{$3) УДК 577.15. (088. 8 ) С,A.Êóäèíîâ, И.М.Бабенко и С.П.Мацуй

%",ф ъ с

tg».;,,, (Ордена Трудового Красного Знамени инстит химйн : им. A.Â.Палладина (72) Авторы изобретения (7! ) Заявитель (54)) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННОГО

ПЛАЗМИНОГЕНА

Изобретение относится к технологии получения иммобнлизованных препаратов и может быть использовано в ферментной промышленности и медицине, а именно в медицине в терапевтических целях, поскольку целый ряд заболеваний человека обусловлен специфической ферментной недостаточностью

Иммобилизация биологически активных соединений, в частности фермен-, тов, широко испЬльзуется для их модификации.-..Таким способом повышают температурную стабильность ферментов, устойчивость к действию денатурирующих агентов, продлевают время действия ферментов.

Плазминоген - профермент основного компонента противосвертывающей системы крови плазмина, основная физиологическая роль которого вЂ” лизнс образовавшихся фибриновых сгустков (тромбов ).

Известны способы иммобилизации плазминогена с помощью ковалентного связывания с носителем. Например, способ иммобилизации плазминогена на активированной бромцианом сефарозе 313.

Наиболее близким. к предлагаемому является способ иммобилизации плазминогена на актнвированной бромцнаном сефарозе. Полученные по этому способу препараты иммобилизованного плаз-. ииногена содержат 0,7 вЂ” 1,3 ".ò белкг на 1 г сухой сефароэы, а удельная активность препарата после активации составляет 1,5-3,1 катрино нтпческих единиц на 1 мг белка 121.

Недостатком укаэанных способов является то, что иммобилизацию плаэминогена осуществляют путем ковалентного связывания, в результате- чего

- снижается фибринолитическая активность и поэтому препараты не могут испЬльэоваться в медицинских целях.

Цель изобретения вЂ” повышение удельной активности целевого продукта.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения иммобилиэованного плазминогена с использованием в.качестве носителя активированной бромицианом сефарозы, в качестве носителя используют связанную с фибриногеном активированную бромцианом сефароэу, а иммобилизацию проводят в 0,1 N фосфате натрия„ рН 7,6 с последующим удалением неспецифически сорбированного плаэми979508

Удельная активность иммобилизованного плаэминогена после активации стрептокиназой,ке/Mr

Содержание активности исходного препарата растворимого плазминогена, Количество плазминогена,иммобилиэированного на 1 мп фибриноген-сефароэы

5 5

5,6

2i3

1,5

3 .М %

15,4

22,4

0,8

30,0 " В 1 и 2 опыте исходная активность 10 ке/мг; "" в 3-6 опытах исходная активность. 6,5 ке/мг. ногена промывкой тем же буфером с добавлением 0,5 М хлористого натрия, При условиях аффинной иммобилизации происходит сорбционное связывание Фермента с носителем на основе естественного биоспецифического срод- 5 ства, что позволяет получить препараты с регулируемой способностью активироваться в плаэмин, Аффинное связывание плазминогена, а после его активации и плазмина, с фибрино- )О геном реализуется не через активный центр, а через лизин-связывающие участки. Активный центр плазмина при соединении с фибриногеном остается свободным и способен взаимодействовать с белковыми субстрами, в частности с казеином.

Пример 1. Активацию сефарозы осуществляют по обычной методике.

Бычий фибриноген подвергают диалиэу против 0,1 М фосфатного буфера при рН 7,8 на холоде в течение 24 ч против 10 л буфера. Затем к 16 мп активированной сефарозы добавляют 71 мл отдиализированного фибриногена. Реак->5 ция связывания протекает при 4 С под аргоном в течение 19 ч.. Несвяэавшийся фибриноген отмывают последовательно 0,1 М фосфатным буфером, рН 7,8 (2-3 л ), 0,1 М трис-фосфатным буфером, рН 8,6;1 М хлористым натрием, 0,025 Я E-аминокапроновой кислотой .(3 л ), 0,1 M трис-фосфатным буфером, рН 4,1; 1 М хлористым натрием и

0,025 М 8-аминокапроновой кислотой, рН 7,6 (2 л ), 0,1 М Н РО4 и 0,2 М глицерином (2 л ); 0,05 И трис-НзРО4, 0,1 М хлористым натрием 0,025 М 8-аминокапроновой кислоты рН 7,6 (2 л).

Отмытую фибриноген-сефароэу хранят при 4 С с NANO>. Эффективность связывания вЂ” 0,150 г фибриногена на 1 r сефароэы (сухой ) или 40 мг на 1 мл серофаэы. 4 мл плазминогена в 0,1 М Фосфатном буфере, рН 7,6 с концентрацией белка 1 мг/мл и удель-.45 ной активностью 10 ке/мг медленно пропускают через 1 мл (осевшей ) фибриноген-сефароэы, упакованной в капиллярную колонку. Неспецифически сорбированный плаэминоген удаляют промыванием колонки этим же буфером,, а затем буфером с добавлением 0,5 M хлористого натрия до исчезновения белка в промывных водах. На геле иммобилизуется 2 мг плаэминогена, удельная активность плаэминоген-фибриноген-сефарозы после активации стрептокиназой 10 ке/мг сорбировавшего" ся профермента. Через этот плазмино ген-фибриноген-гель таким же способом пропущено 2 мп раствора плазминогена, содержащего 2 мг белка. После удаления неспецифически сорбировавшегося плазминогена на геле иммобилиэовалось еще

2 мг белка, удельная активность геля

5,5 «e/мг.

Пример 2. Через колонку, заполненную 2 мп фибриноген-сефарозы пропущено (как описано в примере 1), 2 мл плазминогена с концентрацией

5 мг/мл и удельной активностью

6,5 ке/мг. Затем удаляют неспецифически связавшийся белок (как описано в примере 1 ). На фибриноген-сефароэе иммобилизовалось 3,8 мг белка на 1 мл геля. Удельная активность геля

"5,6 ке/мг °

Через полученную плазминоген-фибриноген-сефарозу тризиды пропускают по

2 мл раствора плаэминогена, содержащего 15 мг белка. После каждого пропускания гель отживают от неспецифически связавшегося белка(пример 1) °

После 1,2 и 3-го пропускания плаэми- ногена содержание плаэминогена в препарате составляет соответственно

15,4; 22,4 и 30,0 мг белка,.а удель-, ная активность снижается до соответственно 2,3 1,5 и 0,8 ке/мг. Результаты испытаний приведены в таблице.

979508

Составитель В.Муронец

Редактор A,Ãóëüêî Техред С.Мигунова Корректор Н.Король

Заказ 9282/99 Тираж 505 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул. Проектная, 4

Таким образом, плаэминоген при связывании с фибриноген-..офароэой в количестве 2 мг на мл геля полностью сохраняют свою активность после активации стрептокиназой. После активации стрептокинаэой активность: плаэмина обнаруживается только в фракции геля и гель может быть мно, гократно использован для определения активности. Это указывает на та, что после активации плаэминогена в плаэмин он остается в связанном с носителем состояний.

Активность полученных препаратов иммобилизованного плаэминогена после активации стрептокиназой близко к исходной активности растворимого плазминогена и значительно превышает удельную активность препаратов, полученных при ковалентной иммобилизации плазминогена (2 3.

Используя предлагаемый способ иммобилизации,:можно достигнуть полного сохранения активности плазминогена при иммобилизации; создавать препараты, обладающие большой емкостью по отношению к плаэминогену для обеспечения организма тромболитическим агентом в случае его недоотаточности; целена1травлено соэ даватЬ лекарственные препараты с заданными свойствамьГпЛ количеству . иммобилизованного плазмйногена и активности.

Этот способ может быть использован в медицинских целях для созда " ния лекарственных препаратов тром болнтического действия.

В отличие от ковалентного связывания, иммобилизации плазминогена осуществляют сорбционно на основе естественного биоспецифического срод,ства, что позволяет получить препараты с регулируемой способностью активироваться в плазмин.

10 Формула изобретения

Способ получения иммобилиэованного плазминогена с использованием в качестве носителя активированной бромцианом сефарозы, о т л и ч а ю щ и й15 с я тем, что, с целью повышения удельной активности целевого продукта, в качестве носителя используют активнрованную бромцианом сефарозу, связанную с фибриногеном, а иммоби2О лиэацию проводят в 0,1 И фосфате натрия, рН 7,6 с последующим удалением неспецифнчески сорбированного плаэминогена промывкой тем же буфером с добавлением 0,5 И хлористого натрия.

25 Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Masaaki Иого1,йоЬио Aoki "isoiation and Characterization of 4 "

Piasmin inhibitor from Human P1esma" допгпаi of В!î1 о9icai Chemictгу, 1976, v. 251, р. 5956-5965.

2. Кудинов С.А.;Ерецкая Е.В."Ак тивация плаэмнногена при его иммо" билизации". Украинский биохимический журнал. Т. 51 1979, Р 4, с.340-344.