Способ получения ауксотрофных мутантов холерных вибрионов

Способ получения ауксотрофных мутантов холерных вибрионов

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

СПОСОБ йоЗ УЧЕИИЯ АУКСОТРОФНЫХ ШТАНТОВ ХОЛЕРНЫХ ВИБРИОНОВ путем вырсшщвания исходной культуры в питательной среде с последующей обработкой полученной культуры мутагеном , пассированием обработанной культуры на плотных питательных средгис и отбором мутантов,, отличающийся тем, что, с целью повьшения частоты выделения Актантов, исходную культуру выращивают в жидкой питательной среде, в качестве | 4утагена используют у)ренный холерный фаг и обработку проводят в полужидком агаре.

СООЭ СОВЕТСНИХ

МЪФЬ

РЕСПУБЛИК

ЗИ) С 12 К 5 0

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ASTOPCHGIUIY СВИДЕТЕЛЬСТВЪ (21) 3213478/28-13 (22) 08.12.80 .(46) 30.06.84. Вюл. В 24 (72) М.С.Дроиевкина, Т.A.Кудрякова и И.И.Богданова (71) Ростовский-на-Дону государственный научно-исследовательский противочумный институт (53) 576.8.093.1(088.8) (561 1. Проблемю ООИ, Ростов-на-Дону, 1972, в. 4 (26), с. 95. (54) (57) СЛОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АУКСОТРОфНЦХ МУТАНТОВ ХОЛЕРНЫХ ВИБРИОНОВ..SU„,) А путем выращивания исходной культуры в питательной среде с последующей обработкой полученной культуры мутагеном, пассированием обработанной культуры на плотных питательных средах н отбором мутантов,. о т л и ч ающи и с я тем, что, сцелью повышения частоты выделения мутантов, исходную культуру выращивают в жидкой питательной среде, в качестве в ута- . гена используют .умеренный холерный фаг и обработку проводят в полужидком агаре.

982345

Изобретение относится к областй медицины, а именно микробиологии.

Известен способ получения ауксотрофных мутантов холерных вибрионов путем выращивания исходной культуры в питательной сРеде с последующей обработкой полученной культуры мутагеном, пассированием обратанной культуры на плотных питательных средах и отбором мутантов (1) .

Однако известный способ сложен 10 и имеет низкую частоту выделения мутантов при проведении генетических исследований.

Целью изобретения является ïîâûшение частоты выделения мутантов. )5

Эта цель достигается тем, что при осуществлении способа получения ауксотрофных мутантов холерных вибрионов путем выращивания исходной культуры в питательной среде с последующей обработкой полученной культуры мутагеном, пассированием обработанной культуры на плотных питательных средах и отбором мутантов, отличительной особенностью

25 является то, что исходную культуру выращивают жидкой питательной . среде, в качестве мутагена используют умеренный холерный фаг и обработку проводят в полужидком агаре.

Способ осуществляют следующим образом. Засевают петлю суточной агаровой культуры холерного вибриона в 5 мп бульона Мартена (pH 7,6-7,8), инкубируют при 37 С 4 ч. Затем

0,3 мл молодой культуры переносят в пробирку с 4 мл 0,7Ъ-ного агара, растопленного и остуженного до 45 и высевают двухслойным методом на поверхности 1,5% агара Мартена в чашке Петри. После застывания верх- 4Q него слоя на газон культуры наносят

2 капли умеренного холерного фага в виде "дорожки". Посев ставят в термостат на сутки при температуре выращивания 37 С . Ha следующий день вырезают участки вторичного роста по дорожке фагового лизиса и помещают в пробирку с 5 мл физиологического раствора. Центрифугируют содержимое пробирки 20 мин при 3000 Об/мин. Насадочную жидкость удаляют, затем добавляют к осадку физиологический раствор до первоначального объема и пробирку помещают в термастат до следукщего дня. Через сутки содержимое пробирки центрифугирущт при тех же условиях, удаляют надосадочную жидкость, добавляют физиологический раствор. Пелученную суспенэию титруют до 10 и высевают иэ разведений

i0, 10, 10 по 0,1 мп на ara- 60 ровые пластинки, чтобы получить рост изолированных колоний (основной посев,исходная чашка). Выращивают 1824 ч при 37 С.Выросшие колонии методом реплик переносят на минимальную среду. После 48 ч инкубации при 37 С с исходной чашки петлей отбирают колонии, не выросшие на минимальном агаре,и готовят взвесь в 1 мл физиологического раствора.По 1 капле взвеси наносят на минимальный агар, агар Мартена и среды, содержащие ростовые добавки . Устанавливают зависимость от тех или иных факторов роста по общепринятой схеме Холлидея. Минимальную сре; ду готовят на забуферном агаре с добавлением сульфата аммония (О, 5 мл

20%-ного раствора на 100 мл), глю козы (0,5 мл 40%-ного раствора на

100 мл) . Аминокислоты, пуриновые и пиримидиновые основания добавляют после предварительной стерили з ации в концентрации 100, мкг/мл сре— ды, витамины после дробной стерилизации в концентрации от О, 001 до

О,1 мкгlмл. Изученные колонии ауксотрофов пересевают с основного посева в столбик 0,3% arapa и сохраняют при комнатной температуре.

Пример. Засевают петлю суточ ной агаровой культуры штамма холерных вибрионов Эль Тор 75 в 5 мл буль она Мартена (рН 7, б — 7,8) и выращивают .при 370С 4 ч. Затем 0,3 мл молодой растущей культуры вносят в

4 мл 0,7Ъ-ного агара, растопленного и остуженного до 4 5 С, и высев ают двухслойным методом на поверхность

1,5%-ного агара Мартена. Через 20 мин на газон культуры наносят 2 капли умеренного холерного фага 8556 в виде "дорожки". Умеренный фаг 8556 получают из одноименного штамма холер ных вибрионов Эль Тор. Штамм — продуцент фага 8556 (инаба) хранится в стобике О,ЗЪ агара Мартена под слоем ваэелинового масла. Фаг получают общеприятным методом. Умеренный фаг образует мутные негативные колонии с прозрачным ободком, в диаметре 1-2 мм. Относится по TI серологичемкому типу фага. Титр фага, исполь. зуемого в предлагаемом способе, может варьировать от п.10 — п.108 фагочастиц в 1 мл. После нанесения фага на газон культуры посев ставят в термостат на сутки при 37" С. На следующий день скальпелем вырезают участки лизиса с вторичным ростом фагоустойчивости культуры и помещают в пробирку с 5 мл физиологического раствора. Содержимое пробирки центрифугируют в течение 20 мин при

3000 об/мин, надосадочную жидкость удаляют, к осадку добавляют физиологический раствор до первоначального объема, и культуру помещают в термостат при 370C . Через 24 ч выращивания пробирку со взвесью центрифугируют при тех же условиях, как описано выше, удаляют надосадочную жидкость, добавляйт физиологический раствор к осадку. Полученную микробную суспенэию титруют до 10 и высевают

982345

Составитель

Редактор П. Горькова Техред С.Легеза Корректор Л.Шеньо

Заказ 4025/4 Тираж 522 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", r.Óæãîðîä, ул.Проектная,4 из разведений 10, 10, 10 по

0,1 мл на агаровые пластинки, чтобы получить рост изолированных колоний (основной посев, исходная чашка). выросшие колонии переносят на минимальную среду методом реплик. Отбор ауксотрофных мутантов, не выросших на минимальной среде, ведут через

2 суток наблюдения с основного посева. Петлей отбирают часть колонии с исходной чашки в 1 мп физиологического раствора в пробирке. По 1 капле взвеси наносят на минимапьный агар, агар Мартена и среды, содержащие ростовые добавки, по общепринятой схеме Холлидея. Учитывают результат. Через 1-3 суток выращивания при 37 отмечают рост íà ara. ре Мартена и средах, содержащих те или иные дополнительные факторы роста. На минимальной среде рост ауксотрофных мутантов отсутствует.

Колонию ауксотрофного мутанта снимают петлей в, исходной чашки в столбик 0,3% агара и сохраняют при комн ат ной температуре .

Предложенный способ применен на 7 штаммах вибрионов Эль Тор: 75, 10 6216, 3639, 5879, 1861-34, 757, 8860, нелизогенных, с прототрофным типом питания. Установлено,что пред- ложенный способ прост по технике выполнения, легко осуществим, сокра35 щение числа переносов ауксотрофов позволяет повысить частоту выделения мутантов при проведении генетиче ски х и с следов ани и .