Способ получения гемолизина

Способ получения гемолизина

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГтаКШИЗИНД путем (иваш1Я гемопизинпродзщирующего -штамма в жидкой питательной среде с последзпющим офдеяениём жидкой фазы, содержащей целевой продукт, о т ли ч а ющи йен тем, что, с целью повышения выхода гемолизина, используют штамм Vibrio Nag Р-11702, а. выращивание ведут на среде, содержащей экстракт дрожжей с 30 мг % аминного азота и.0,3% глицерина.

„SU„,;982347

СОЮЗ СООЕТСНИХ

AININWHC

РЕСПУБЛИК эап С г N 1/00

ГОСУД СТВЕННЫЙ КОМИТЕТ ССОР дВв вВ вввв М в

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ в двчвванввх савдввввсгвв (21) 3275956/28-13 (22) 01.04.81 (46) 15.12.84; Бюл. Ф 46 (72) Б.Н. Ииюанькин, А.В. Родионова, 8.А. Рачицкая и Л.В. Романова (71) Ростовский-на-Дойу государственный научно-исследовательский.противочумный институт (53) 576.8.093.1(088.8) (56) 1. J. Sacter 1966 ° 9), В 1, 461-462 (прототип).

\ (54)(57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГЕИОЛИЗИ1Щ путем выращивания гемолизинпродуцирующего ютамма.в жидкой питательной среде с последующнм отделением жидкой фазы, содержащей целевой продукт, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода гемолизина, используют ютамм -Vibrio Nag P-11702, а выращивание ведут на среде, содер-. жащей экстракт. дрожжей с 30 мг X аминного азота и О,ЗХ глицерина. женин кроликов-сосунов НАГ-вибрионы в дозе и-10 " не вызывают особых патологических изменений.

Штамм несет хромосомальную мутацию к рифампицинорезистентности (более 100 мкг/мл), которая является с одной стороны, его селективным маркером, а с .другой способствует лучшей эксперсии исследуемого признака. Так, установлено, что гемолитическая активность устойчивых клонов штамма с вероятностью 0,95 вьппе 63 1, 5/594,9 — 668, 1/ по сравнению с чувствительными 562,5/530.9-594,1).

Штамм V.Nag характеризуется выраженной гемолитической активностью и не обладает гемолизин-дест-„ руктивным фактором (энтеротоксином) .

При сравнительном изучении продукции гемолизина в различных жицких питательных средах сказалось, что в пептоновой воде ее практически не наблюдается. В бульонах Мартена, Хоттияге= ра и казеоново-ферментативяом гемолитическая активность очень низкая, тогда как в дрожжевой (30 мг 7. аминного азота) отмечается стимуляция этой активности.

Продукция гемолизина клетками

Р-11702 в жидких питательных средах (37, рН 7,8, 24 ч инкубации)

Гемолитическая активность, ед/мл культур жидкости

8,0

7,0

Бульон Мартена

Бульон Хоттингера

Бульон казеиново— ферментативный .2,0

Бульон дрожжевой 34,0

17-ная пептоновая вода 1,0

Получение гемолизияа иэ клеток предлагаемого штамма продуцента осуществляют.следующим образом, Пример. Взвесь 18 ч агаровой культуры (агар Мартена, рН 7,6) гемолизин-продуцирующего штамма вибри- она P-11702 переносят в дрожжевой бульон, рН 7,6, приготовленный из очищенного дрожжевого экстракта (30 мг 7. аминного азота) с 0,37 глицерина. Культуру инкубируют 20-24 ч при.37 С со встряхиванием. С целью обеззараживания эа 2 ч до конца срока инкубации в культуру добавляют мертиолат (конечная концентрация

0,00017) . Клетки отбрасывают центри1 982347 2

Изобретение относится к медицинской микробиологии.

Известен способ получения гемолизина путем выращивания гемолизинпродуцирующего штамма в жидкой питатель5 ной среде с последующим отделением жидкой фазы, содержащей целевой продукт (11.

Однако известный способ не обеспечивает высокого выхода целевого продукта.

Целью изобретения является повышение выхода гемолиэина.

Цель достигается тем, что при осуществлении способа получения гемо15 лизина путем выращивания гемолиэинпродуцирующего штамма в жидкой питательной среде с последующим отделением жидкой фазы, содержащей целевой продукт, используют штамм Vibrio

Nag P-11702, а .выращивание. ведут яа среде, содержащей экстракт дробей с ЗО мг 7. аминного азота и 0,37. глицерина. Штамм Ч. Nag Р-1172 выцелен из речной воды и имеет следующие морфологические и физиологические характеристики. Клети его в виде изогнутых палочек, с умереняо выраженным полиморфизмом, величиной 1,5-2,0 х х 0,3-0,4 мк. На пластинах 1,5-2ь

30 агаре Мартена (рН 7,6-7,8) через

12-16 ч вибрионы штамма вырастают в

Виде окРуглых нежных полУПРОЗРачных Среда в проходящем и слегка голубоватых в отраженном свете колоний. В бульоне и пентонной воде НАГ-вибрион в процессе роста дают равномерное помутнение и образуют пленку.

Штамм V. Nag Р-11702 обладает оксидазной активностью, ферментирует глюкозу в среде Хью и Лейфсояа в аэробных и анаэробных условиях,ферментируют маннит, сахароэу, маннозу, но не расщепляют арабинозу, лактозу, инозит. Обладает протеолитической, диастатической и лецнтиназной активностями, образует индол и нв:-..:продуцирует сероводорода,декарбоксилирует лизин и орнитин, но не имеет дигидро- лазы аргинина. Характеризуется прото-50 трофным типом питания на искусствеяных средах.

Холерными сыворотками "О", Инаба, . Огава и R-О вибрионы этого штамма не агглютинируются, к холерным фа- 55 гам С, Эль, Тор, ХДФ-Ç, 4,5 вибрионы не чувствительны и являются нели-. зогенными. При внутрикишечном эараРедактор О. Фипиппова Техред С.Иегуиова.

Корректор О. Тигор

Заказ 9206/2 Тираж 521 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Paymcaas наб, ° д. 4/5

Филиал НПП "Патент", r. Ужгород, ул. Проектная, 4

3 9.82347 фугированием при 5000 об/мин, рН препарата гемолизина составляет 250надосадочной жидкости устанавливают 640 усл. ед/мг сухого веса.

7,4 и насыщают до 60Х. сухим сульфа- Для определения гемолитической актом аммония (рН 7,4). Через 18 ч .тивности необходимо иметь свежую (40) осадок собирают центрифугирова- g кровь здорового кролика, которую нием ресуспендируют в 0,01 М фосфат- дважды отжвают физиологическим растном буфере, р8 7,4, с ЭДТА (0,001 И) вором с нейтральным значением рН и диалиэнруют против этого же буфера:путем центрифугирования при3000 об/мин. до полного удаления следов сернокис- Осадок разводят 1:5 и из полученной лого аммония. Проверенный на гемоли- 1О суспензии готовят разведение эритротическую активность колориметричес- щитов, под которой понимают такую ким способом препарат подвергают лио- взвесь, которая после разведения дис" фнлизации при естественном подогреве. тилированной водой в 20. раз дает

Удельная активность выщеукаэанного экстракцию 0,25.