Способ получения плацентарного лактогена

Способ получения плацентарного лактогена

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

<ц983127

ОП ИСАНИИ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Союз Советск ив

Социалистических

Республик (61) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 24.06.81 (21) 3307237/28 — 13 с.присоединением заявки ¹ (28) Приоритет (5i)M. Кл.

С 07 G 7/026

//А 61 К 35/50

9мударотеаивй комитет

СССР до делам иэооретекик и открьпня

Опубликовано 23.12.82. Бюллетень № 47 (53) УДK 615.45:

:612/433.664 (088.8) Дата опубликования описания 23.12.82 (72) Авторы изобретения

О. П. Шевченко, Д. Д. Петрунин, Т. M. 1jàãàðàåâà и Н. И. Огольцова

2-й Московский ордена Ленина государствениьщ ай@ институт им. Н. М. Пирогова (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПЛАЦЕНТАРНОГО

ЛАКТОГЕНА

Изобретение относится к биохимии, в частности к препаратив и технологической биохимии, и может быть использовано для.,получения очищенных биологически активных препаратов, применяемых в медицине с целью

5 контроля за развитием беременности, оденки функционального состояния фето — плацентарной системы и диагностики осложнений беременности, Известен способ получения плацентарного лактогена иэ плаценты путем экстракции трис — глициновым буфером, последовательного осаждения при рН 6,5 и,4,5 сернокислым аммонием, колоночной хроматографии на амберлите С G — 50, повторного осаждения сернокис- лым аммонием, диализа, лиофилизации> иэоэлектрического осаждения и фракционирования зтанолом (1).

Однако этот способ трудоемок и не обеспечивает высокого выхода белка.

Известен также способ получения плацентар- 20 ного лактогена, включающий измельчение плаценты человека, зкстракцию физиологическим раствором, обработку раствором риванола и . последующее выделение целевого продукта (22.

Известный способ также не обеспечивает достаточно высокого выхода белка, является длительным и сложным из — за необходимости использования дорогостоящих реактивов и оборудования.

Целью изобретения является увеличение выхода целевого продукта.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения плацентарного лактогена, включающему измельчение плаценты человека, экстракцию физиологическим раствором, обработку раствором-риванола и последующее вьщеление целевого продукта, экстракт плаценты обрабатывают равным объемом окиси алюминия, полученный осадок последовательно отмывают дистиллированИой водой, раствором хлористого. натрия и вновь дистиллированной водой, затем злюируют насыщенным раствором двузамещенного гидрофосфата натрия, полученный элюат обрабатывают раствором риванола, осадок растворяют в растворе хлористого натрия; фильтруют, полученную фракцию обрабатывают силикагелем, полученный осадок отмыва. ют последовательно дистиллированной водой, 98312 раствором сернокислого аммония и вновь дистиллированной водой, после чего элюируют

Раствором углекислого натрия, элюат диализуют

DpnTFIB дистиллированной Bnttt t tt JtttncbttttH3ttpvloT.

Пример 1. Зрелую плаценту, отмытую от крови, измельчают, добавляя равный объем физиологического раствора, полученную смесь растирают до получения гомогенной массы и замораживают. После 3-кратного замораживания и оттаивания гомогенат центрифугируют в тече- 10 ние 30 мин при 8000 g. К 500 мл полученной в результате центрифутирования надосадочной жидкости добавляют 500 г влажной окиси алюминия„смесь инкубируют прн постоянном помешивании 20 мин, затем центрифугируют

20 мин при 8000 g, надосадочную жидкость удаляют, а осадок отмывают 10 — кратным объемом дистиллированной водь1, трижды отмывают равным объемом 10%-ного раствора хлористого натрия и вновь отмывают 10-кратным объемом дистиллированной воды, каждый раз удаляя осадок с помощью центрифугирования, К отмь1тому таким образом сорбенту добавляют 500 мл насыщенного раствора двузамещенного гидрофосфата натрия, инкубируют 20 мин g при постоянном помешивании, центрифугируют.

К полученной надосадочной жидкости добавляют

500 мл 0,5 -ного раствора риванола и оставляют на сутки при 4 С. Образовавшийся осадок отделяют центрифугированием, растворяют в

400 мл 10%-ного раствора хлористого натрия, фильтруют через бумажный фильтр, Полученный фильтрат обрабатывают равным объемом влажного силикагеля, инкубируют при постоянном помешивании в течение 20 мин, центрифугируют

20 мин при 8000 g. Oñàäîê отмывают 10 — крат35 ным обьемом дистиллированной воды, 3-кратным объемом 30 o-ного раствора сернокислого аммония и вновь 10 — кратным объемом дистиллированной воды. К полученному при помощи

40 центрифугнрования сорбенту добавляют 300 мл

10 o-ного раствора углекислого натрия, инкубируют 20 мин, осадок отделяют центрифугированием, надосадочную жидкость диализуют про. тив дистиллированной воды и лиофилиэируют.

Таким образом, иэ l кг плаценты получают

35-40 мг препарата плацентарного лактогена с чистотой 95%.

Пример 2. Зрелую плаценту экстрагируют физиологическим раствором и адсорбируют на окиси алюминия, как описано в примере 1. Сорбент отмывают 10 — кратным объемом дистиллированной воды, 3-кратным объемом ..

8% ного раствора хлористого натрия и вновь

10-кратным объемом воды. К отмытому адсорбенту добавляют 400 мл насыщенного раствора 5 двузамещенного гидрофосфата натрия, инкубируют 20 мин, центрифугируют при 8000 g 20 мин. Надосадочную жидкость осаждают ри7 4 ванолом, как описано в примере 1. Образовавшийся осадок отделяют центрифугированием, растворяют в 300 мл физиологического раствора, фильтруют, нолучеъшый фильтрат адсорбируют на силикагеле, как описано в примере 1, сорбент отмывают 10-кратным объемом дистил. лированной воды, 3-кратным объемом 35%-його раствора сернокислого аммония и вновь 10кратным объемом воды. К отмытому адсорбенту добавляют 150 мл 8 o-ного раствора, углекислого натрия, инкубируют 20 мин, осадок удаляют центрифугированием, а надосадочную жидкость диализуют против дистиллированной воды и лиофилизируют. Получают 40 — 45 мг препарата плацентарного лактогена, с чистотой

90 — 95%.

Пример 3. Плаценту обрабатывают, как описано в примере l. Полученный препарат плацентарного лактогена растворяют в физиологическом растворе (1 мг препарата в 1 мл раствора), добавляют 1 мл 2%-ного раствора алюмокалиевых квасцов в качестве альюванта и, используют для получения антисывороток.

Таким образом, используя предлагаемый, способ, из 1 кг сырья (плаценты) можно получить 40 мг препарата плацентарного лактогена. с чистотой 95%, обладающего хорошей иммуноMHHocTbIo для кроликов, в то время, как по известному способу 10 — 15 мг из I кг сырья, т. е. предлагаемый способ позволяет получить препарат не уступающий по качеству известному. втрое увеличив при этом его выход. Способ также отличается технической простотой и непродолжительностью, не требует применения дорогостоящих реактивов и оборудования.

Формула изобретения:.

Способ получения плацентарного лактогена, включающий измельчение плаценты человека, экстракцию физиологическим раствором, обработку раствором риванола и последующее выделение целевого продукта, о т л и ч а юшийся тем, что, с целью увеличения выхода целевого продукта, экстракт плаценты обрабатывают равным объемом окиси алюминия, полученный осадок последовательно отмывают дистиллированной водой, раствором хлористого натрия и вновь дистиллированной водой, затем элюируют насьпценным раствором двузамещенного гидрофосфата натрия, полученный элюат обрабатывают раствором риванола, осадок растворяют в растворе хлористого натрия, фильтруют, полученную фракцию обрабатывают силикагелем, полученный осадок отмывают последовательно дистиллированной водой, раствором сернокислого аммония и вновь дистиллированной водой, после чего элюируют раствором углекислого натрия, !

Составитель В. Брусиловская

Техред Ж.Кастелевич Корректор Н. Бурак

Редактор Г. Волкова

Тираж 388

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

И3035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Заказ 9834/29

Подписное

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4

5 983127 6 элюат днализ гат против дистиллированной стапфе . immuno1ogica11y related to pituitary воды и лиофилизирувт. growth hormone.— ЕпдосгЬо1офу", v. 71, Источники информации, рр. 209 — 220,- 1962. принятые во внимание при экспертизе . 2. Bohn Н. Kristal1 isation and Hochgerel1. Josimovich А В. и Maclaren А A. Pre- 5 nigung des Human Placenta lactogens.—

sence in the human of à highly 1actogenic sub- "Eperimentia», 1971, ч. 27, р. 1223.