Линия перевиваемых клеток селезенки взрослой зеленой мартышки 455,используемая для культивирования вирусов

Линия перевиваемых клеток селезенки взрослой зеленой мартышки 455,используемая для культивирования вирусов

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Линия перевиваемых,клеток селезенки взрослой зеленой мартышки 455, 45 (Коллекция штаьимов Института вирусологии им. Д.И. Ивановского), используемая для культивирования вирусов.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ сОцИАлистичесних

РЕСПУБЛИН (19) (11) Ц51) С 12 1ll 5/00

ГОсудАРстВенный НОмитет сссР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ABTOPCH0MV СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 3313756/28-13 (22) 01.07.81 (46 ) 30.09.83 . Вюл. )) 36 (72) Л.Л. Миронова, Ю.Х. Хапчаев и В.Д. Попова (53) 576.8.093.35(088.8) (56) 1. Авторское свидетельство СССР

)) 764390, кл. С 12 К 7/00, 1980. (54 ) ЛИНИЯ ПЕРЕВИВАЕМЫХ КЛЕТОК СЕЛЕЗЕНКИ ВЗРОСЛОЙ ЗЕЛЕНОЙ МАРТЫШКИ 455, ИСПОЛЬЗУЕМАЯ ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ВИРУСОВ (57) Линия перевиваемых,клеток селезенки взрослой зеленой мартышки

455, 9 45 (Коллекция штаммов Института вирусологии им. Д.И. Ивановского), используемая для культивирования вирусов.

984214

Изобретение относится к области вирусологии и микробиологии.

Известна линия перевиваемых клеток, полученная из почек зеленых мартышек, используемая для культивирования вирусов (1) .

Однако известная линия перевиваемых клеток не обеспечивает растущих потребностей в этих биологических моделях.

Целью изобретения является расши- . 1О рение области клеточных субстратов.

Линия перевиваемых клеток селезенки взрослой зеленой мартышки 455, используемая для культивирования вирусов, хранится в коллекции штаммов 15

Института вирусологии им. Д.И. Ивановского под Р 45.

Линию перевиваемых клеток получают следующим образом.

Животных обескровливают путем 20 перерезания яремных вен. Селезенки экстирпируют и помещают во флакон спитательной средой. В асептических условиях удаляют сосудистый пучок, селезенку переносят в чашку Петри 25 и отмывают от крови 0,02Ъ-ным раствором версена, затем обрабатывают

0,025Ъ-ным раствором трипсина. Диспергенты нагнетают непосредственно в устья трабекулярных артерий с помощью аппарата Боброва (можно использовать перистальческий насос)По окончании перфузии орган помещают в сосуд с питательной средой и размешивают на магнитной машалке. Полученную клеточную взвесь высевают в культуральные сосуды. В качестве ростовой среды для получения первичной культуры используют 0,5Ъ-ный раствор гидролизата тактальбумина на растворе Хенкса со срецой Игла 40 в равных соотношениях с добавлением

10Ъ-ной сыворотки крупного рогатого скота. При субкультивировании можно использовать основную среду Игла, среду.

Игла МЕМ с добавлением 3-10Ъ-ной сы- 45

HopoTIcH крупного рогатого cKQTcl

Полученная линия перевиваемых клеток селезенки взрослой зеленой мартышки 455 имеет следующие.морфологические и биологические свойства. Куль- 50 тура представлена полигональными эпителиоподобными клетками, цитоплазма не вакуолизирована, ядро содержит мелкозернистый гетерохроматин с 2-3 ядрышками. Клетки линии 455 .образуют монослой через 24-48 ч после субкуль- " тивирования, причем монослой удается получить даже при внесении в 1,5 л матрасную колбу 3 10 клеток. Количество клеток при образовании монослоя в 1,5 л матрасной колбе дости- 6О гает 35-40 млн.клеток ° Время удвоения поппуляции обычно составляет

18 ч. Коэффициент раэвивки достигает величин 1:3, 1:4. Для пассирования клеток используют основную среду Игла,65 среду Игла МЕМ, 0,5Ъ-ный раствор гидролизата лактальбумина на растворе

Хенкса со средой Игла в равных соотношениях с добавлением 2-10Ъ-ной сыворотки крупного рогатого скота.

Клетки линии 455 не контаминированы бактерияги, грибами, микоплазмами.

Посторонние вирусы не выявлены ни в культуральной жидкости, ни в самих клетках. Тесты на онкогенность также были отрицательными.

По мерр размножения клетки замораживают на разных уровнях пассажей для хранения в жидком азоте, таким образом создан их запас (10 10 клеток).

Клетки линии 455 сохраняются в жидком азоте без снижения пролиферативной активности, при восстановлении сохраняют жизнеспособность на 85-90Ъ в течение 3 лет (время наблюдения).

Клетки линии 455 способны длительное время (20 дней) оставаться на стекле без субкультивирования и смены среды, а также выдерживать агаровое покрытие с аминопептидом и бикарбонатом натрия.

Клетки линии 455 чувствительны к различным вирусам: вакцинным штаммам вируса полиомиелита, рино- и эховирусам. При заражении вирусом среду из культуральных сосудов сливают, клетки промывают раствором Эрла и вводят вирусосодержащую жидкость.

Затем добавляют. поддерживающую среду, в качестве которой используют смесь 0.,5Ъ-ного раствора гидролизата лактальбумина на растворе Эрла со средой Игла в равных количествах.

Инфицированные культуры инкубируют при оптимальных температурах затем проводят сбор .вируса и определяют его титр по методу образования бляшек или по цитопатогенному действию.

Приводятся примеры культивирования вирусов на линии клеток селезенки взрослой зеленой мартышки 455.

H p и м е р 1. Культивирование вируса полиомиелита, штамм Сэбина

1 типа.

Монослой линии перевиваемых клеток 455 на уровне 32 пассажа снимают с поверхности 1,5 л матрасной колбы следующим образом; сливают культураль. ную жидкость, клеточный слой ополаскивают холодным (4 С) 0,02Ъ-ным раствором версена, затем обрабатывают в течение 15-30с холодным (4 C)

0,25Ъ-ным раствором трипсина. фипсин сливают и матрасную колбу с клетками оставляют при комнатной температуре на 1-2 мин до начала отслоения клеток со стекла. Клетки ресуспендируют в среде роста — Игла МЕМ с

5Ъ сыворотки крупного рогатого скота.

Взвесь разливают на 3 матрасные колбы. Эти культуры на уровне 33 пассажа инкубируют при 37 С в течение 2

984214

Редактор П. Горькова Техред И.Тепер Корректор A. Ильин

Заказ 8252/7 Тираж 523 Подписное

ВНИИПИ.Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул. Проектная, 4 суток до формирования сплошного пласта клеток.

При заражении вирусом полиомиелита штамм Сэбина 1 типа среду из культуральных сосудов сливают, клетки промывают раствором Эрла и вводят вируссодержащую жидкость из расчета

3 БОЕ на клетку. Затем добавляют поддерживающую среду, в качестве которой используют смесь 0,5Ъ-ного раствора гидролизата лактальбумина на .растворе Эрла со средой Игла в равных количествах.

Инфицированные культуры инкубируют о при 34 С. Сбор вируса проводят на

4 день после заражения и определяют 15 его титр по методу образования бляшек

Титр составляет 7,8 1g БОЕ/мл.

При культивировании вируса в первичной культуре клеток почек обезьян получают титр 7,5 1д БОЕ/мл. 20

Пример 2. Культивирование вируса полиомиелита, штамм Сэбина 2 типа.

Клетки линии 455 на уровне 33 пассажа получают и заражают вирусом по способу, описанному в примере 1.Титр вируса составляет 7,7 1g БОЕ/мл.

При культивировании вируса в пер вичной культуре клеток почек обезьян получают титр 7,5 1g БОЕ/мл.

Пример 3. Культивирование вируса полиомиелита, штамм Сэбина

3 типа. Клетки линии 455 на уровне

ЗЗ пассажа получают и заражают вирусом 11Q способу, описанному -в примере 1. Титр вируса составляет 7,7 1g

БОЕ/мл.

При культивировании вируса в пер- . вичной культуре клеток почек обезьян получают титр 7,6 1р БОЕ/мл.

Пример 4. Культивирование 40 вируса ECHO-11. Клетки линии 455 на уровне 32 пассажа получают по способу, описанному в примере 1, только клетки по 2 10 эксплантируют в проЯ бирки. 45

При заражении вирусом среду из пробирок сливают и вносят 1,8 мл среды Игла MEM без сыворотки, затем вводят 0,1 мл вируссодержащей суспенэии в разведении 10 - 10 . Заражают по 4 пробирки на разведение. Куль

I туру инкубируют при 37"С в течение

1 недели до развития четкого цитопатического эффекта.

Параллельно аналогичным способом заражают первичную культуру клеток почек обезьен. Титр вируса в культуре 455 бил равен 10 ТЦД /мп, в первичных 10 ТЦД<,/мл.

Пример 5. Культивирование риновируса.

Клетки линии 455 на уровне 32 nactax

Титр вируса в культуре 455 бып равен 10 в ТПД@/мл. Аналогичные результаты были получены в первичной культуре клеток почек обезьян.

° Предлагаемое изобретение способствует расширению клеточных Субстратов, используемых для культивирования вирусов. Применение линии клеток 455 приводит к уменьшению экономических затрат для культивирования вирусов. Применение линии. клеток 455 приводит к уменьшению зкономических затрат для культивирования вирусов в связи с тем, что, во-первых, она может заменить дорогостоящие первичные культуры клеток почек обезьян (40 106 клеток почек обезьян стоят 28 рублей, а линии

455 2 руб,) во-вторых, получение линии клеток из селезенок позволяет повысить степень утилизации органов дорогостоящих обезьян (стоимость одной обезьяны 150 руб.). Кроме того, клетки линии 455 обладают высокой пролиферативной активностью, легко культивируются на отечественных средах и сыворотках и могут быть использованы для оценки их качеств. Клетки линии 455 не теряют своих свойств при хранении в жидком азоте в течение 3 лет (время наблюдения) и создан значительный их запас на разных уровнях пассажей (10 104 клеток).

Вышеуказанные свойства клеток линии 455позволяют значительно упростить и удешевить способ культивирования вирусов, а также расширяют возможности успешной диагности. ки вирусных инфекций.