Способ получения иммобилизованной люциферазы

Патент 987976

Авторы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННОЙ ЖЩЙФЕРАЗЫ путем экстракции фермента из лампочек светляков буферным раствором с послед гаощёй обработкой экстракта полисаха риднмм полимерным носителем, активиФованянм бромцианом, отличаюta , и И с я тем, что, с целью увеличения удельной активности иммобилмэованного фермента и повышения степени извлечения активного фермента из экстракта, экстракцию осуществляют фосфатным буфером с ионной силой 0,5 М при весовом соотноше нии лампочки светляков : буфер 11:40-10, а обработку экстракта пояимером проводят при весовом соотно- v шении лампочки светляков : полимер 1:1-3. 2, Способ по n.i, о т л и ч а-ющ и .и с я тем, что, в качестве полисахаридного носителя исполь- ;3уют сефарозу, целлюлозу целлофановую плёнку, ультрагель и Ультрадеке . 3. .Способ по П.1, о т л и ч а ющ и и с я тем что, с целью экономии , фермента, отработанный epttievtный экстракт повторно используют для иммобилизации фермента.

()9) (10

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

3(59 С 12 Н 9 02 С 12 1(11 10 ОСУДАРСТ ЕКК((Й КОМИТЕТ СССР

Il0 ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕКИЙ ИОТНРЫТИЙ

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМ,Ф СВИДЕТЕЛЬСТВ,Ф. (21) 3298668/28-13 (22) 08,06.81 (46) 23.02;84. Бюл. В 7 (72) Н.Н. Угарова, Л.5. Бровко, Е.И., Беляева, Л.В, Иванова и И.В. Березин (71) Московский ордена Ленина, ордена Октябрьской Революции и ордена Трудового Красного Знамени государственный университет им. М,,В. Ломоносова (53) 577.15.07(088,8) (54)(57) 1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННОИ ЛЮЦИФЕРАЗь1 путем экстракции фермента иэ лампочек светляков буферным раствором с последующей обработкой экстракта полисахаридным полимерным носителем, активи рованным бромцианом, о т л и ч а юшийся тем, что, с целью увеличения удельной активности иьеаобили эованного фермента и повышения степени извлечения активного фермента из экстракта, экстракцию осуществляют фосфатным буфером с ионной силой 0,5 М при весовом соотношении ламйочки светляков : буфер

11!40-10, а обработку экстракта поли мером проводят при весовом соотношении лампочки светляков t полимер

1.-.1 3. .2. Способ по п.1, о т л и ч а- ющ и.й с я тем, что, в качестве полисахаридного носителя исполь« эуют сефароэу, целлюлозу, целлофановую пленку, ультрагель и ультрадекс.

З..Способ по п.1, о т л и ч а ю - 3 шийся тем, что, с целью экономии. фермента, отработанный фермеитный экстракт повторно используют для иммобилизации фермента.

987976

Недостатком данного способа иммобилизации люциферазы является недостаточная удельная активность получаемого препарата и неполное извлечение активного фермента из экстракта. При повторной -обработке надосадочной жидкости полимером процент извлечения фермента крайне мал. По-видимому, оставшийся непро65

Изобретение относится к биохимии, а именно к способу получения иимобилизованной люциферазы, в частности люциферазы светляков. Этот фермент широко используется в лабораторной и медицинской практике для 5 аналитического определения аденозин-5 -трифосфата LATP ), Определение ATP служит для целей медицинской диагностики и для анализа загрязнений окружающей среды. В частности в медицине этот метод используют для ранней диагностики инфаркта миокарда, для определения чувствительности к антибиотикам.и т.п. Определение ATP в водоемах 3S и в морской воде позволяет оценить их биологическоую продуктивность и наличие загрязнений. Растворимая люцифераза отличается высокой лабильностью, что затрудняет ее использование на практике. Поэтому

20 разработка методов стабилизации люциферазы, в частности ее иммобилизации, приобретает важное практическое значение, 1 25

Известен способ иммобилизации ноцифераэы светляков на аминированном стекле с помощью глутарового альдегида. Однако препараты иммобиюцифераэы полу этим способом, сохраняют только

0,07-0,16% исходной активности фермента.

Йзвестен также способ получениями иммобилиэованной люцифераэы светляков, который заключается в следующем.

Навеску обезвоженных лампочек светляков экстрагируют при 4 С е

0,02 М трио-ацетатным буфером с 40 ионной силой 0,1-0,2 М, содержащитл хлорид натрия и этилендиаминтетраацетат (ЭДТЛ). В ходе экстракции используют 100-кратный по весу избыток буфера по отношению к весу 4 лампочек светляков. Полученный экстракт обрабатывают 5-кратным по отношению к взятой навеске сырья избытком полимерного полисахаридного носителя, активированного бромцианом. В качестве носителя используют сефарозу или сефадекс.

Получают препарат иммобилизованной люцифераэы светляков, сохраняющий

10-12% исходной активности с удель- 55 ной активностью 500-700 MB/ìã. экстрагированным фермент быстро инактивируется в растворе в условиях ,эксперимента.

Целью изобретения является ловышение удельноей активности иммобилизованного фермента при увеличе йии степени извлечения активного

1фермента иэ экстракта.

Цель достигается при реализации описываемого способа получения иммобилиэованной люциферазы светляков, включающим экстракцию фермента иэ лампочек светляков буферным раствором и последующую обработку полученного экстракта полимерным полисахаридным носителем, активированным бромцианом, причем экстракцию осуществляют фосфатным бубером с ионной силой 0,5 М при весовом соотношении лампочки светляков:буфер

1:40-10 „ и обработку экстракта полимером проводят при весовом соотношении лампочки светляков:полимер

1:1-3. Обычно в качестве полисахаридного носителя используют сефарозу, сефадекс, ультрагель (сМешанный полимер, полиакриламида и агарозы, ультрадекс (гель декстрана1, целлофановую пленку, целлюлозу.

С целью экономии фермента отработанный Фер лентный экстракт можно повторно использовать для иммобилизации фермента, для экстракции используют 0,1 М фосфатный буфер, содержащий 0,2 М,NsC1 и 2 мМ ЭДТА.

Экспериментально показано, что замена трис-ацетатного буфера на фосфатный с большей ионной силой обесt печивает большую стабильность фермента.

Способ осуществляют следующим образом.

Экстракт лампочек светляков в фосфатном буфере встряхивают с активированным носителем при 4 С в о течение 24 ч при укаэанном выше соотношении компонентов. Изменение весового соотношения лампочки светляков: полимер как в сторону увеличения, так и в сторону уменьшения приводит к уменьшению удельной активности получаемой иммобилизованной люциферазы. Надосадочную жидкость отделяют и снова встряхивают с полимером в тех же условиях.

В результате такой обработки экстракта носителем получают препарат иммобилизованной люциферазы с удельной активностью 2000-5000 мВ/мг при сохранении 20-25% исходной активности люциферазы.

Пример 1. 300 мг тонко растертых .лампочек светляков экстрагируют 6 мл 0,1 М фосфатного буфера 0,2 М NaCl, 2 мМ ЗДТА рН 8 О) в течение 40 мин при 4чС. Полученную суспензию центрифугируют

987976

Составитель О. Скородумцева

Редактор П. Горькова Техред М.Надь Корректор Г Огар

Заказ 1138/5 Тираж 522 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва Ж-35 Раушская наб., д. 4/5.Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектяая, 4 (15.000 об/мин, 10 мин, 5 C) . Раствор отделяют. Полученный водный экстракт люциферазы обрабатывают

300 мг сефарозы, актнвированной

BrCN. Суспенэию встряхивают при 4 Св течение 24 ч . Полученный в результате полимер с ковалентно присоединенной люциферазой отделяют на стеклянном фильтре. Надосадочный раствор повторно обрабатывают 300 мг

BrCN-активированной сефарозы в тех же условиях, Оба последовательно полученные препараты иммобилизоваиной люциферазы имеют одинаковую удельную активность, 5000 мВ/мг. В результате сохраняется 20% исходной активности люциферазы.

Пример 2. 80 мг тонко растертых светляков экстрагируют 2 мя

0,1 М фосфатного буфера (0,2 И МаС1;

2 мМ ЭДНА рН 8,0). Надосадок отделяют и 2 раза последовательно .обрабатывают порциями по 240 мг

:BrCN-активированной сефароэы тем же способом, что и в примере 1.удельная активность обоих препаратов иммобилиэованной люциферазы 2000 мВ/мг при сохранении 25% исходной актив:ности люциферазы."

Пример 3. 500 мг тонко рас..тертых лампочек светляков экстрагируют 5 мл 0,1 И фосфатного буфера, 0 2 М МаС1, 2 мМ ЭДТА рН 8,0, Надосадок отделяют и обрабатывают

500 мг BrCN-актнвированной сефарозы тем же способом, что и в -предыдущих примерах. удельная активность

5 полученного препарата 4000 мВ/мг при сохранении 15% исходной активности люцифераэы.

Пример-.=» 4. 400 мг тонко растертых лампочек светляков экстрагируют 6 мл 0,1 И фосфатного буфера, 10 О 2 М NsC1 2 мИ. ЭДТА рН 8 0 ° Надосадок отделяют и добавляют к нему

400 мг BrCN-активированного ультрадекса. Иммобилизацню проводят так же, как и в предыдущих примерах.

15 Удельная активность ивелобилиэованных на ультрадексе препаратов

2500 мВ/мг при сохранении 2ОВ исходной активности люциФеразы.

Предлагаемый способ иммобилизации

2О позволяет получать препараты с удельной активностью в 3-10 раа больше, чем с помощью известных методов. Процент извлечения активного фермента возрастает в 2-2,5 раза.

Применение стабильных и высоко.,активных препаратов иммобилизованной люцифераэы в анализе позволяет добиться высокой точности и воспроЗп иэводимости, упрощает методику; а также приводит к уменьшению расхода самого фермента.