Штамм облигатно-метилотрофной бактерии @ @ всб-792

Штамм облигатно-метилотрофной бактерии @ @ всб-792

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Штамм облигатно-метилотрофной бактерии Methylobacillus methylophllus БСБ-792 (коллекция Всесоюзного научно-исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов №ЦМПМ В-1946 - продуцент белково-витаминцой биомассыГ (Л

СОЮЗ С(.ЕЕТСНИ)(РЕСПЮЛИН (19) (11) A "-(()ЮЗИ

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

Il0 ДЕЛАМ ИЭОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3210844/30-15 (22) 03.12 ° 80 (46) 15. 10.85. Бюл. У 38 (72) Э.М. Диканская, М.Б. Долгая, Н.П. Калунянц, Г.С. Родионова, П.Н. Фишер, Е.Н. Кондратьева, А.И. Нетрусов и, P.Н. Ивановский (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт биосинтеза белковых веществ (53) 664.38(088.8) (56) 1. Со1Ьу J. et al., Ann. Rev.

Microbiol., 1979, 33, 481-517.

2. Диканская Э.М. и др. Ж. Микробиологическая промьппленность. 1974, 9 11, с. 119.

З.Jardy F.R. et al., Int.J. of

Systematic Bacteriology, 1977, 27, с. 247. (5!)4 С12Р2100 С R126 (54) ШТАММ ОБЛИГАТНО-МЕТИЛОТРОФНОЙ

БАКТЕРИИ HETHYLOSACILLUS МЕТНИ OPHILUS ВСБ-792., (57) Штамм облигатно-метилотрофной бактерии Nethylobacillus methylophilus БСБ-792 (коллекция Всесоюзного научно-исследовательского института генетики и селекции промышленнык микроорганизмов ФЦМПМ В-1946 - продуцент белково-витаминцой биомассы.

89867 2

15

25

35

45.Значительно меньше найдено облигатных метилотрофов, хорошо растущих только за счет одноуглеродных соеди- 55 пений, в частности метанола.

В СССР штаммов облигатных метилотрофов нет, а для получения белковоI 9

Изобретение относится к области микробиологического синтеза белка и физиологически-активных соединений и представляет собой новый штамм бактерий — продуцент белкововитаминной биомассы на основе метанола.

Получение микробной биомассы на основе метанола — один из эффективных путей. обеспечения народного хозяйства и, в первую очередь> животноводства белково-витаминными концентратами. Планами развития народного хозяйства предусматривается органиэация крупнотоннажного промышленного производства микробной биомассы из метанола, как источника кормового белка и витаминов.

Создание отечественного фонда культур, активно растущих за счет метанола и обладающих ценными для производства признаками, является необходимым условием развития такого производства и представляет собой важную народнохозяйственную задачу.

Известно много различных штаммов бактерий-метилотрофов, способных развиваться за счет метанола 1).

Систематика этих бактерий мало разработана и многие из селекционированных штаммов их авторы OTHOсят к новым видам и даже новым родам, не описанным в существующих определителях, в частности в наиболее полном определителе бактерий (Bergey s manual of Delerminative

Bacterio1.ogy 1974,8-th Edition,Baltimore, USA) .

Большинство известных штаммов метилотрофных бактерий охарактеризовано, однако, лишь в условиях периодического культивирования или не представляет практического интереса благодаря недостаточно высоким для промышленного применения показателям.

Из числа известных штаммов основная масса принадлежит факультативным метилотрофам, способным помимо метанола потреблять источники углерода, содержащие два и более углеродных атома. витаминной биомассы из метанола предложены два факультативно-метилотрофных штамма Pseudomonas methanolica

sp. nev. и КИ-4 (27, Но эти штаммы очень неустойчивы к инфицирующей микрофлоре, полностью вытесняются посторонней микрофлорой из процесса, обладают сравнительно низкой скоростью роста, растут при скорости протока 0,16-0,18 ч с невысоким выходом биомассы (около 407), уступая по указанным показателям облигатнометилотрофным штаммам, предлагаемым за рубежом.

Наиболее близким к предложенному штамму по технической сущности, физиолого-биохимическим и культуральным признакам является облигатно-метилотрофный штамм Methylobacillus

glucogenes gen, nov. sp. nov. (3).

Это облигатный метилотроф и облигатный аэроб, хорошо растущий на минеральной среде с метанолом при

30 С и рН 6,8-7,0. Из источников углерода использует только метанол и метиламин. Морфологически. представляет собой неподвижные на всех стадиях палочки, размером 0 5-0,8х1,0-1,6 мкм, встречающиеся поодиночке и парами, спор не образует. Окраска по. Грамму отрицательная, тест на каталазу положительный. Колонии на синтетической среде с метанолом округлые димеfpoM оКопо 0,4 MM блестящие, гладкие, непигментированные, Иолярное содержание гуанина и цитозина в ДНК составляет 54,1 молярных X.

Поли-р-оксимасляной кислоты не накапливает, но в определенных условиях лимита по азоту образует гликогеноподобное вещество. Оптимальная температура — 30, при 37 С рост прекращается. При оптимальных значениях температуры и рН (около 7) максимально короткое время удвоения составляет 2,9-3,5 ч, что соответствует скорости роста 0,28-0,43 ч ..

Штамм испытан при периодическом выращивании в условиях качалочных опытов. По выходу биомассы и содержанию в ней белка штамм не охарактеризован.

К недостаткам штамма, которые выявляются даже в условиях периодического выращивания, относятся недостаточно высокая скорость роста и низкий температурный оптимум.

Цель изобретения состоит в селекции нового штамма мет .лотрофных

989867 4 ки не обнаружены. Размеры односуточных клеток с синтетической среды О ° 3-0,5 х 1,5-1,8 мкм, размножаются би2 нарным делением, спор не образуют.

Окраска по Грамму отрицательная. Колонии на агаризованной синтетической среде с метанолом округлые до 0 ° 5 мм в диаметре, выпуклые, с гладким краем, блестящие, полупрозрачные, 1р непигментированные.

1$

35

Штамм Methylobacillus methylophi1us ВСБ-792 депонирован в центральной коллекции промышленных микроорганизмов института ВНИИгенетика"

Главного управления микробиологической промышленности при Совете

Иинистров СССР под номером ЦИПВ

В-1946.

Штамм ВСБ-792 характеризуется следующими свойствами.

Иорфологические признаки.

Клетки в форме палочек с закругленными концами, расположенное пооди— ночке или попарно, могут образовывать длинные нити, неподвижны, жгутиз бактерий с улучшенными свойствами.

Для достижения цели предложен штамм облигатно-метилотрофной бактерии

Methylobacillus methylophilus ЭСБ-79 (коллекция Всесоюзного научно-исследовательского института генетики и селекции промьппленных микроорганизмов) — продуцент белково-витаминной биомассы.

Пример 1. Предлагаемый штамм Methylobacillus methylophil

ВСБ-792 выделен из бактериального комплекса, спонтанно образовавшегося в процессе непрерывной ферментации метанола в нестерильных условиях при рН 6,8-7,0.

Идентификацию предлагаемого штамма проводили по определителю бактерий (Bergey s manual of. Determ.

Bact., 8-th. Ed. Balt, USA) и описаниям облигатных метилотрофов в оригинальных статьях, перечисленных в табл. 1. Из таблицы видно, что по сумме признаков предлагаемый штамм

ВСБ-792 ближе всего подходит к облигатно-метилотрофным бактериям рода Methylobacillus. Предлагаемый штамм как и бактерии рода Methylobacillus, помимо ряда общих с другими облигатными метилотрофами признаков, отличает отсутствие подвижности, отсутствие пигментации и близкое молярное соотношение в ДНК суммы гуанина и цитозина. На основании сходства морфологических и культуральных признаков заявляемый штамм

ВСБ-792 отнесен к роду Methylobacillus и на основании имеющихся отличий от единственного известного вида этого рода Methylobacillus

glucogenes (см. таблицу) определен как новый вид Nethylobacillus

methylophilus sp. nov. физиологические и культуральные признаки.

Облигатный аэроб, максимум роста при рН 6,8-7,0 и температуре 30"ЗУС, хорошо растет при 37 С. Облигатный метилотроф. Не использует соединения с двумя и более углеродными атомами: спирты (этанол, пропанол, изо-пропанол, н-бутанол, изо-бутанол, амиловый и иэоатиловый спирты, глицерин, маннит, дульцит), органические кислоты (формиат, ацетат, оксалат, гликолат, пируват, лактат, пропионат, сукцинат, бутират, фумарат, малат, малеат, О -кетоглутарат, цитрат), сахара (глюкозу, фруктозу, сахароэу, галактозу, ксилозу лактозу, мальтозу, рамнозу). Иэ С-соединений хороФ шо растет только на метаноле. Метан, метиламины, формальдегид и формиат не потребляет.

Не растет на обычных средах - молоке, мясо-пептонном агаре (МПА), мясопептонном бульоне (МПБ), мясопептонной желатине. В качестве источника азота использует соли аммония, хуже нитраты. Нитриты из нитратов не образует. Сероводород, индол, поли-«-оксимасляную кислоту не образует, но может выделять в среду большое количество слизи (полисахариды).

Ауксоавтотроф, в витаминах и других дополнительных факторах роста не нуждается. Тесты на каталазу и оксидазу положительны. Иолярное содержание гуанина и цитозина в ДНК составляет 55,7+0,4 молярных й.

Предлагаемый штамм ВСБ-792 непатогенен, Штамм ВСБ-792 хорошо растет на минеральных средах с метанолом с высокой скоростью роста до D -=

0,5 ч "(время удвоения до 2 ч), характеризуется высоким выходом биомассы, который может превышать

50Х к заданному метанолу, и высоким содержанием белка (сырой протеин) 989867 более 807 к сухому весу, а также соединенный витаминной и коферментной природы, в частности витамина

1 В, до 100 мкг/г, иэ них до 70 мкг/г в коферментной форме в виде флавинадениндинуклеотида (ФАД), а также более 1000 мкг/г никотинамиддинукле-. отида (НАД-кофермента).

Штамм стабилен при непрерывном выращивании, легко поддерживается в лабораторных условиях, нелиэогенен.

Предлагаемый штамм Methylobacillus methyloph. ВСБ-792 отличается от наиболее близкого прототипа

Methylobacillus glucogenes по следующим признакам: не использует, метиламин, не накапливает гликогеноподобного вещества при дефиците азота, обладает более высокой скоростью роста — Д = 0,5 ч ", вместо Д вЂ” 0,280,34 ч " у прототипа (или по минимальному времени удвоения — 2 ч по сравнению с 2,9 ч у прототипа) хорошо растет в более широком интервале температур: у прототипа при

37 С рост прекращается, а заявляемый штамм продолжает развиваться при о

37-38 С. Влияние температуры на рост заявляемого штамма представлено в табл. 2 °

Иэ таблицы видно, что предлагаемый штамм ВСБ-792 одинаково хорошо растет при 30 и 35 С а при 38 С отмечается лишь небольшое снижение выхода.

Пример 2. Штамм Methylobacillus methylophilus ВСБ-792 выращивали непрерывным споообом в асептических условиях в лабораторных аппаратах 0,7 л с полезным объемом 0,3 л при рН 6,8-7,0 и

30 С на среде состава г/л:

КС1. 69,5

HgSO 7Н,О 18,2

ГеЯОф -7Н,О 4,8

lnSOg .7Н О 3,3

МЗО, -5Н, О 3,6

CuSO . 5H О 0,4

Н, PO (707.) 58 мл

Концентрация метанола в притоке составляла 17.. Источником азота служил аммиак, который вводили по мере подкисления среды.

Выращивание проводили при скорости протока Д-0,25 ч ". В этих условиях выход биомассы по абсолютно сухому веществу к заданному метанолу состав50

Таким образом, селекционирован новый штамм облигатно-метилотрофной бактерии Methylobacillus methyloph.

ВСБ-792 с улучшенными свойствами, способный активно развиваться на средах с метанолом с высокой скоростью роста до Д-0,5 ч ", в широких пределах температуры до 38 С с оптимумом 30-35 С и обеспечивать высокий выход биомассы, более 50Х к заданному метанолу. Штамм образует более 80% сырого протеина, а также лял в среднем 527.. Биомасса содержала в пересчете на абсолютно .сухое вещество 85Х сырого протеина, 106.мкг/г витамина В,, 70 мкг/л флавинадениндинуклеотида (ФАД)

1200 мкг/г никотинамиддинуклеотида (НАД), 3-87 липидов, Пример 3. Штамм Nethylo10 bacillus methyloph ВСБ-792 культивировали так же как в примере 1, но при 35 С, при той же, что в примере 1 скорости протока Д-0,25 ч " .

Выход биомассы по абсолютно сухому

15 веществу к заданному метанолу составлял 527.

Пример 4. Штамм Methylobacillus methylophil. ВСБ-792 культивировали в тех же условиях, 20 что и в примере 1, но при температуре выращивания 38 С. Выход биомассы к заданному. метанолу составлял 477.

Пример 5. Штамм Methylo25 bacillus methylophil ВСБ-792 культивировали тем же способом, что и в примере 1, но в аппаратах емкостью 30 л, в нестерильных условиях и скорость протока доводили до

Д-0,4 ч 1. Выход биомассы по абсолютно сухому веществу при скорости протока Д-0,4 ч " составлял 547 к заданному метанолу, содержание сырового протеина доходило до 857.

За 140 ч выращивания в нестерильных условиях штамм не вытеснялся иэ процесса инфицирующей микрофлорой и не менял своих свойств.

Пример 6. Штамм Methylo40 bacillus methylophilus ВСБ-792 культивировали так же и в тех же аппаратах, что в примере 4, но скорость протока доводили до Д-0,5 ч"1, Выход биомассы по абсолютно сухому

45 веществу к заданному метанолу при

Д вЂ,0,5 ч " составлял 467.

7 9898 ценные соединения витаминной и коферментной природы, в частности, витамин В, около 100 мкг/г сухого веса, в том числе около 70 мкг/г в виде флавинадениндинуклеотида (ФАД) и более 1000 мкг/г никотинамиддинуклеотида (НАД-кофермент). Штамм вы1 деляет в среду в определенных условиях большие количества полисахарида, который может иметь практи- 1О ческое значение, Штамм Nethylobacillus methylophil.

ВСБ-792 представляет собой первую в СССР культуру облигатно-метилотрофных бактерий. Этот штамм, как продуцент белково-витаминной биомассы, не уступает по промышленно-Ценным свойствам лучшим зарубежным штаммам облигатно-метилотрофных бактерий, предлагаемым для производства микробной биомассы на основе метанола и по некоторым показателям превосходит их, Заявляемый штамм имеет существенные преимущества перед факультативно-метилотрофными бактериями, в том числе используемыми в СССР в качестве продуцентов микробной биомассы на основе метанола Pseudomonas

methanolica u Pseudomonas KU-4.

Сравнение показателей селекционированного штамма Nethylobacillus

67 8

methylophilus с используемыми в СССР факультативно-метилотрофными штаммами представлено в табл. 3.

Из представленной таблицы отчетливо видны преимущества заявляемого штамма перед используемыми в настоя- . щее время в СССР.

Применение предлагаемого штамма позволит за счет более высокой скорости роста, способности к росту в более широких пределах температу-. ры, а также высокому выходу богатой белком биомассы и большей устойчивости к вытеснению инфицирующей микрофлорой в два с половиной раза уменьшить стоимость биомассы на метаноле, обеспечить более стабильный процесс с меньшей вероятностью вытеснения продуцента при инфицировании, а также расширить общйй фонд имеющихся облигатных метилотрофов и фонд штаммов-продуцентов белково-витаминной биомассы на основе метанола, имеющийся в СССР.

Экономия от внедрения предлагаемого штамма вместо используемого в настоящее время для опытной установки производительностью по микробной биомассе 10 тыс. т в год составит по предварительным расчетам

530 тыс. руб.

989867

1

1

1

1> Х

Х

> 1

СЦ

М

Й

0 ъ Э ,с н и са

Э т-4 и

Д

63 х л cd &»

Р ) Р1 E Э л О Э

Ю О О Д

Р> o W со

1 а ю х

1 о х

Э ъ

Д

Ц о

>о о а

Д

П х 1 х

Г» о М

1

I х

4> о

I „„

N 1 х .х

>-4 Д»

° о ,Д Н

Р. О о о

7 .И

4.> u

Э Э

Х В о о

Е»

Э

А

1» о х

Ю о о

Е

lU ф

«» (б

1 х о

И о м

Я >)

5 5 о о

v х

>Я

» .> х

«» х

Ц

Ю ъ>

I »

О ) » ъо

Д о е о а

Е»

>0 о а (т >

1 х а о х

Д Э

Е

О «»

Cd Х а и о

Х1 х

° ъ о «»

:ь

М х х а д х

>-> о о х»

1

1

lх

Х

31

>»

1 о х

Я

Э ld

Й

Я О

»-4 о о

>-1 (Ф .й .Д м н

Э «U F

Е Я

1

Э х х а

Ю>

Д . llj х

Э

«» о

О о х

>х .>j х х

«» х

Ю

О) л

СО ъо

Э ъ

А

1 о х х

td

«» й;. >-!

О Я

Э ) о э

»-4 Ы) ъ O ,а и

4.3 «1

Э 4

Е аО

А

Ц

Ф х а

«-> и

dJ

Д (>ъ х

«

dJ ъ

И

А !

» о

Ю о ! с 1

Ю л с»4

1

1

1

«»

Э ъ

Л ( о

1»

v х

ld «»

«» Э

О Э

О Д о о

1 Д

Ю л Д

Р 1 Э х х

А

Д

Э

«

П!

:т х

o„

»

C)

+I л л

>Г\

»

> ° х

1-

>» х

Ц

1

Щ о м

Д

В о

И х о а

1 а

Э Д

Ц о х

v x х

llJ Х

o r m х о а э х х дхы о э

Х Ф х

>»

Ц Э ь а х >

А

3 а

Е Э х

Х

И Э

o « х а

g»

Х Д д о

Д Д

Е» и о х

М ! о

I

1»

Х

ld

Х а о 9

«-> о х х х

lU

8 о х

«"

Ю к

Ю (Ч

ЭЮ х к х и

Э х

«» и о

Г>4

Х с5 х х а ! х

Д

« и

>х о

Д

О

Э х х

Э х

Д

Э а

Ю

1 I

> — — — >

I Д е-4 1

1 д.й о с

Я о

1 О л

4 О! ъИ,Й Э.м

i Э QJ

1 Й 6

> — — — — — ->

l

1

»

i ! сх

Х х

; о 3

1

1

1

I ! !м

1,(>> ! о

1х

«» >/

Э Р") х 1

С>

Р) 1

Д

gj х

ld л «»

О ъо О о

СО! г

989867

Таблица 2

Выход биомассы у штамма ВСБ-792 в условиях непрерывного выращивания при разных температурах

Температура, Длительность Выход биоо

С процесса, ч массы в Х к метаиолу

30

100

100

53

100

Предлагаемый штамм

ВСБ-792

Показатели культур

Используемые штаммы

КИ-4

30; повышение до 37 подавляет рост

30-35 выдерживает 38

Пределы температуры для роста, С

Достигнутая скорость протока в непрерывной культуре, ч

0,25-0,50

0,16-0,20

Выход по сухому веществу, 7 к метанолу

46-54

36-40

Белок (сырой потеин), 7 к сухому веществу

80-85

Витамин В,, мкг/г сухого вещества

106

Устойчивость к инфицированию

Сохраняется в нестерильных условиях

Вытесняется целиком г

Техред Т.Дубинчак

Корректор В. Гирняк

Редактор Л. Утехина

Заказ 7019/1 Тираж 524 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Иосква, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал !ПП! "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Таблица 3

Сравнительная характеристика Methylobacillus methylophilus ВСБ-792 и штаммов, используемых в СССР— Pseudomonas metanolica sp. nov. и КИ-4 при выращивании в одинаковых условиях