Способ приготовления противовирусных вакцин

Способ приготовления противовирусных вакцин

Реферат

 

(19)SU(11)991634(13)A1(51)  МПК ⁶    _{A61K39/135, C12N7/00}(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯк авторскому свидетельствуСтатус: по данным на 17.12.2012 - прекратил действиеПошлина:

(54) СПОСОБ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ПРОТИВОВИРУСНЫХ ВАКЦИН

Изобретение относится к биологии, ветеринарии и может быть использовано в приготовлении вакцин. Известен способ приготовления вакцин, включающий соединение водной фазы, содержащей вирусный антиген, с масляной фазой, содержащей минеральное масло, ланолин и эмульгаторы, и последующее эмульгирование. Недостатком способа является низкая иммуногенность, технологическая трудоемкость, связанная с двукратным эмульгированием. Целью изобретения является повышение иммуногенности ящурной вакцины. Поставленная цель достигается тем, что в качестве эмульгаторов используют смесь гипсофилина или сапонина с холестерином, взятых в количестве 5-7 и 0,5-1,0% соответственно от веса вакцины, причем гипсофилин или сапонин предварительно добавляют к инактивированному антигену, а холестерин вводят в масляную фазу, затем полученные смеси соединяют в равных объемах и эмульгируют. Ускорение наступления иммунитета достигается за счет введения в состав компонентов эмульгированной вакцины наряду с минеральным маслом и ланолином эмульгаторов гипсофилина или сапонина и холестерина с выраженным адъювантным действием. Снижение вязкости происходит в результате образования множественной эмульсии, а снижение реактогенности за счет использования оптимальных количеств компонентов и введения в состав эмульсии не реактогенного масла (парфюмерного масла ГОСТ 4225-75). П р и м е р 1. Для приготовления эмульгированной противоящурной из вируса А₂₂ вакцины были подготовлены три смеси ингредиентов, приведенные в табл. 1. Наиболее предпочтительной является смесь, содержащая, мас. инактивированный антиген 44, гипсофилин или сапонин (20%-ный водный раствор) 6, парфюмерное масло 43,25, ланолин 6, холестерин 0,75. Способ приготовления эмульгированной вакцины из лапинизированного вируса ящура типа А₂₂ сводится к приготовлению множественной эмульсии, состоящей из масляной и водной фаз, которые смешивают в равных пропорциях. Масляную фазу с эмульгаторами готовят путем добавления 10-14% безводного ланолина и 0,5-1% холестерина к основе парфюмерного масла. Смесь стерилизуют автоклавированием при температуре 110-120^оС в течение 1 ч, а затем охлаждают до 20-30^оС. Водную фазу готовят путем добавления 2% гипсофилина или сапонина к водному раствору антигена и тщательного их перемешивания. Антиген готовят следующим образом. 10%-ную суспензию из лапинизированного вируса ящура готовят на растворе Хенкса или ацетатно-аммониевом буфере. При постоянном перемешивании в суспензию добавляют 10%-ный раствор полиэтиленимина до концентрации 0,2-0,5% Перемешивание суспензии продолжают до наступления флоккуляции белков. После образования флоккул приступают к экстрагированию связанного с растворенными белками полиэтиленимина путем последовательной обработки суспензии хлороформ и полиакриловой кислотой. При эффективном перемешивании в суспензию добавляют 5 об. хлороформа, который эмульгируют в суспензии с помощью коллоидных мельниц или гомогенизаторов. Суспензию с хлороформом перемешивают до ее обесцвечивания. В обесцвеченную суспензию добавляют 0,006% полиакриловой кислоты, которая образует с полиэтиленимином нерастворимую поли-соль, удаляя из суспензии оставшуюся часть растворенного комплекса полиэтиленимин белок. Суспензию, очищенную полиэтиленимином, хлороформом и полиакриловой кислотой, сепарируют до прозрачности не менее 90% при проверке 20 мм слоя суспензии на ФЭК-М против дистиллированной воды при красном светофильтре. Затем суспензию фильтруют через стерилизующие пластины СФ, ГОСТ 480-41, диаметром 300 мм, используя многорамные фильтровальные аппараты из расчета одна пластина на 30-50 л антигена. Фильтрование ведут при давлении 0,5 атм в течение 6 ч. В очищенную и фильтрованную суспензию при постоянном помешивании добавляют 4%-ный раствор формальдегида в количестве 1% от объема суспензии, устанавливают рН в пределах 8,2-8,6 с помощью гликоколового буфера или 5 М раствора аммиака и проводят инактивацию вируса при температуре 25-26^оС в течение 48 ч с периодическим перемешиванием (один раз в час в течение 5 мин). После инактивации рН суспензии устанавливают в пределах 7,6-7,8 путем добавления 5% -ного раствора соляной кислоты или 5 М раствора уксусной кислоты и охлаждают до 4-6^оС. После проверки авирулентности на мышатах-сосунах антиген концентрируют полиэтиленгликолем (ПЭГ) с мол.в. 6000. С этой целью к антигену добавляют 10% ПЭГ и NaCl до конечной концентрации 0,5 М. Раствор перемешивают до полного растворения добавленных компонентов и оставляют на 2 сут. Температура раствора в течение 2 сут должна быть 4^оС. По истечении указанного времени осадок отделяют центрифугированием при 2-3 тыс. об/мин в течение 20-30 мин. Полученный осадок растворяют в растворе Хенкса или ацетатно-аммониевом буфере, 1/10 объема от объема исходной суспензии. К полученному антигену добавляют 2% гипсофилина или сапонина в виде 20%-ного раствора на ацетатно-аммониевом буфере или растворе Хенкса и получают водную фазу. Предварительно гипсофилин или сапонин стерилизуют автоклавированием при 105-110^оС в течение 1 ч и значение рН полученного раствора доводят до 7,6. Приготовление эмульгированной вакцины ведут путем диспергирования водной фазы в масляной, т.е. путем диспергирования концентрированной суспензии инактивированного вируса с гипсофилином или сапонином и парфюмерного масла в присутствии эмульгаторов холестерина и безводного ланолина. Для этого равные объемы (с колебанием не больше 5%) суспензии инактивированного вируса с 2% гипсофилина или сапонина и парфюмерного масла с холестерином (1%) и безводным ланолином (10%) смешивают на коллоидных мельницах типа IV-8 или IV-10. В результате получают эмульгированную вакцину, которая представляет собой молокоподобную жидкость, легко растворимую у воде. При длительном хранении вакцины происходит незначительное отделение водной фазы (5%), но при встряхивании препарат вновь превращается в однородную молокоподобную жидкость. Вакцина имеет жидкую консистенцию (10-30 сСт), легко рассасывается с места введения, не вызывает образования абсцессов и обладает выраженной иммуногенной активностью для лабораторных и сельскохозяйственных животных. Иммуногенная активность противоящурной эмульгированной вакцины для мышей и морских свинок приведена в табл. 2. Из данных табл. 2 видно, что 50%-ная иммунизирующая доза противоящурной эмульгированной вакцины и лапинизированного вируса А₂₂ для мышей была равна 0,0125 мл, для морских свинок 0,034 мл. Внутримышечная вакцинация подсвинков эмульгированной противоящурной вакциной в дозе 0,5 и 1,0 мл сопровождалась появлением в сыворотке крови вируснейтрализующих антител с титром: на 20 день 4,0-6,5 лог₂ и на 30 день 3,23-6,5 лог₂. При контрольном заражении вакцинированных животных вирусом ящура, адаптированным к организму свиней, путем введения 10000 мышиных ЛД_{50/0,2 мл} в две точки слизистой языка установлена полная устойчивость к генерализованной форме ящура. Контрольные (невакцинированные) животные заболели генерализованной формой ящура через 72 ч. При патолого-анатомическом осмотре убитых животных в месте введения вакцины обнаружены едва заметные соединительно-тканевые вакциальные узелки. П р и м е р 2. На основе множественной эмульсии, полученной как описано в примере 1, была приготовлена инактивированная культуральная вакцина против вируса ВБСт. В составе 100 л вакцины входят, мас. Суспензия инактиви- рованного вируса 45-43 Гипсофилин или са- понин (20%-ный вод- ный раствор) 5-7 Парфюмерное масло 42-44,5 Безводный ланолин 5-7 Холестерин 0,5-1 Эмульгированную вакцину против ВБСт готовят по следующей технологии. В качестве антигена используют штамм вируса везикулярной болезни свиней Т-75, адаптированный к монослойной культуре клеток IB-RS-2 с титром инфекционности и не ниже 10^7,0 ТЦД_50/мл и прошедший не более 10 пассажей в данной клеточной системе. Результаты изучения иммуногенной активности противоящурной эмульгированной вакцины на свиньях приведены в табл. 3. Полученный вирус предварительно очищают от суспензии клеток центрифугированием при 2500 об/мин в течение 20 мин. Затем в вирусную суспензию добавляют 10% -ный раствор гексаметафосфата натрия на дистиллированной воде из расчета 10 мл раствора на 1 л обрабатываемой жидкости. Вируссодержащую суспензию тщательно перемешивают и устанавливают рН 4,0-4,2 с помощью 1 н. раствора HCl. После получасового контакта при комнатной температуре помутневшую суспензию центрифугируют в течение 30 мин при 2500 об/мин. Полученный осадок ресуспендируют в солевом растворе Хенкса (рН 8,0), уменьшая объем в 10 раз по сравнению с исходным. К гомогенату добавляют 20% хлороформа, шуттелируют 10 мин и центрифугируют в течение 15 мин при 2500 об/мин. рН центрифугата устанавливают в пределах 7,6-7,8 путем добавления гликоколового буфера с рН 9,9. Затем таким же образом проводят вторичное осаждение полученного вируса гексаметафосфатом натрия. Полученный осадок ресуспендируют в растворе Хенкса рН 8,6, уменьшая объем еще в 10 раз. Таким образом получают материал, концентрированный в 100 раз по сравнению с исходным. Аналогично вирус можно концентрировать полиэтиленгликолем (ПЭГ). Для этого в вируссодержащую суспензию добавляют 0,14 М NaCl и ПЭГ-6000 (до конечной концентрации 7% ), тщательно перемешивают и оставляют при 4^оС на 18 ч. После этого центрифугируют при 3000 об/мин в течение 30 мин. Осадок ресуспендируют в растворе Хенкса (рН 8,0), трижды отмывая его методом центрифугирования при 3000 об/мин в течение 20 мин и уменьшая конечный объем в 100 раз по сравнению с исходным. Надосадки после каждого отмывания смешивают вместе и очищают хлороформом в 10%-ной концентрации. До инактивации материал хранят при 4^оС и консервируют 0,02% азида натрия. Вирус инактивируют путем добавления в вируссодержащую суспензию 0,05% аминоэтилэтиленимина, значение рН суспензии доводят гликоколовым буфером до 8,4. После чего помещают на инактивацию в термостат с температурой 260,5^оС на 40 ч. В процессе инактивации вирусную суспензию периодически тщательно перемешивают. После окончания срока инактивации значение рН суспензии доводят 1 н. раствором HCl до 7,2-7,4. Затем составляют вакцину, технология приготовления которой сводится к приготовлению множественной эмульсии, состоящей из масляной и водной фаз, которые смешивают в равных пропорциях. Масляную фазу готовят следующим образом. В подогретое до 80^оС парфюмерное масло (ГОСТ 4225-75) вносят 10% по объему расплавленного при 80^оС безводного ланолина и 1,5 г холестерина, после чего смесь тщательно перемешивают встряхиванием до полного растворения ланолина и холестерина. Затем масло автоклавируют при 120^оС в течение 1,5 ч. Водную фазу готовят следующим образом. Исходный инактивированный антиген с выявленным содержанием вирусного белка (150 S компонента) разводят раствором Хенкса с таким расчетом, чтобы в 1 мл антигена содержалось 7,2 мкг 150 S компонента. Расчет ведут по формуле X где Х необходимое количество исходной инактивированной суспензии вируса, мл; V необходимый для составления вакцины объем антигена, мл; 6 доза 150 S компонента вируса ВБС, необходимая для составления вакцины, мкг/мл; N количество 150 S компонента вируса ВБС в исходной инактивированной суспензии вируса ВБС мкг/мл. В стерильной дистиллированной воде растворяют гипсофилин или сапонин, после чего значение рН полученного раствора доводят до 7,6. Затем раствор стерилизуют автоклавированием при 120^оС в течение 1,5 ч. После разведения антигена до необходимой концентрации 150 S компонента к антигену добавляют 20% раствора гипсофилина или сапонина, таким образом получая водную фазу. Приготовление вакцины ведут путем диспергирования водной фазы в масляной. Для этого равные объемы (с колебанием не больше 5%) антигена с гипсофилином или сапонином и парфюмерного масла с холестерином и безводным ланолином смешивают на коллоидных мельницах типа IV-8 или IV-10. В результате получают эмульгированную вакцину против вирусов ВБС, которая представляет собой молокоподобную жидкость, легко растворимую в воде. При длительном хранении вакцины происходит незначительное отслоение водной фазы (5%), но при встряхивании препарат вновь превращается в однородную молокоподобную жидкость. Вакцина имеет жидкую консистенцию (10-30 сСт), легко рассасывается с места введения, не вызывает образования абсцессов и обладает выраженной иммуногенной активностью для свиней в дозе 0,5 мл. Образцы вакцин, полученные указанным способом, испытывали на свиньях весом 25-30 кг. Свиней разбили на три аналогичные группы по 4 животных в каждой. Животных всех групп иммунизировали внутримышечно в дозе 0,5 мл. Первую группу животных заражали через 3 дня после вакцинации, вторую через 7 дней и третью через 14 дней. Результаты опыта приведены в табл. 4. Из данных, приведенных в табл. 4, видно, что животные первой и второй групп были полностью устойчивы к заражению гомологичным вирусом в дозе 10⁴ ИД₅₀. Из 4 животных третьей группы генерализованной форме болезни ВБС противостояло 3 животных при 100%-ном заболевании в контрольной группе. Таким образом, инактивированная культуральная вакцина против ВБС на основе сложной эмульсии является эффективным и высокоиммуногенным препаратом и может с успехом использоваться для профилактики ВБС. Споcоб приготовления противоящурной вакцины позволяет получать выcокоэффективную иммуногенную вакцину, cнизить трудоемкоcть ее получения.

Формула изобретения

СПОСОБ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ПРОТИВОВИРУСНЫХ ВАКЦИН, включающий соединение водной фазы, содержащей вирусный антиген, с масляной фазой, содержащей минеральное масло, ланолин и эмульгаторы, и последующее эмульгирование смеси, отличающийся тем, что, с целью повышения иммуногенности, в качестве эмульгаторов используют смесь гипсофилина или сапонина с холестерином, взятых в количестве 5-7 и 0,5-1,0% соответственно от массы вакцины, причем гипсофилин или сапонин предварительно добавляют к инактивированному антигену, а холестерин вводят в масляную фазу, затем полученные смеси соединяют в равных объемах и эмульгируют.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2