Способ получения монокариотического мицелия гриба coriolus versicolor (fr) quel

Способ получения монокариотического мицелия гриба coriolus versicolor (fr) quel

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

Союз Советских

Социалистических

Республик

991954

К ПАТЮНТУ (6() Дополнительный к патенту (22) Заявлено 300877 (2l ) 2515254/28-13

3 (51) N. Кл.

С 12 и 1/00 (23) Приоритет - (32) 30.08. 76

ГесударстаеанааЯ кеюзвтет

СССР ю делаю юебретенаЯ

II ФткРмтиЯ (31) . 51-103379 (33) Япония (53) УДК 576 ° 8. . 093. 1 (088 ° 8) Опубликовано 230183, Бюллетень% 3

Дата опубликования описания 230183

1

Иностранная .@ирма

"Куреха Кагаку Когио Кабусики Кайся" (Янония) все

М (73) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МОНОКАРИОТИЧЕСКОГО МИЦЕЛИЯ

ГРИБА СОЙ30; Ъ$ VERS i COLOR (FR) QUEL

Изобретение относится к микробио-, логической промышленности и касается получения полисахаридов, которые мо" .гут быть использованы в медицине для получения лекарственных препаратов, а также в пищевой проюалаленности, Известен способ получения моно.кариотического мицелия грибов Pofyporus cigietus путем культивирования на специально подобранной среде (11 .

Однако известный способ относится к истинному монокариотическому ьжцелию, который развивается непосредственно 1 э определенной споры, со-15 держащей только одно ядро.

Целью изобретения является получе- . ние монокариотнческого мицелия гриба

СоriоPus vers i color (Fr) Que P.

Цель достигается тем, что согласно способу получения монокариотического мицелия гриба Согiotus ver-.

sicolor (Fr) QueP заключающемуся в том, что дикариотический мицелий гриба измельчают в жидкой среде, затем измельченный мицелий вносят в жидкую питательную среду, содержащую 5-10% глюкозы и 0,75-1,5Ъ экстракта дрожжей, культивируют в аэробных условиях при концентрации кислорода 5-.

20 об.В и температуре 25+ 5 С до об" разования монокариотического мицелия, далее полученную культуральную жидкость гомогенизируют и культивируют в тех же условиях до образования гомогенной пульпы.

При этом с целью повышения выхода целевого продукта часть гомогенизированной культуральной среды, полученной.от предыдущей культивации, многократно пересевают в свежую питательную среду и культивируют в тех же условиях.

Монокариотический мицелий гриба получают путем механической обработки, например, измельчения дикариотического мицелия гриба Coriofus versicolor (Гг) Que P в жидкой среде. Этот мицелий измельчают добавлением неак тивного гранулированного материала, например стеклянных бус.

При непрерывном выращивании ди" кариотического мицелия в погруженном состоянии, выращивание ведут при срезе мицелия при -помощи перемешиваемо го элемента, в этом случае мицелий срезают или измельчают гомогенизатором в такой степени, чтобы визуально

991954 не определялось наличие мицелия в ви" де пластинок.

Создают обогащенные питательные условия применением среды с 1, 5-3 раза более высокой концентрацией,чем в обычной среде, например глюкозо-дрожжевым экст- 5 рактом,содержащим 0,75% дрожжевого экстракта и 5% глюкозы.

Атмосферу погруженной культуры подцерживают при сниженном парциаль- ном давлении кислорода. Такое снижен->() ное давление кислорода создают .при воздушной герметизации ферментора или подачей в ферментатор инертного газа, например газообразного азота или двуокиси углерода. Выращи- 15 вание ведут непрерывно при дополнительной подаче культуральной среды.

Таблица 1

j В

Монокариотический мицелий

Свойства

Внешний вид: погружная культура плоская культура

Микроскопические наблюдения:

Ь образование сцепляющих соединений

Не наблюдаются форма мицелия

Физиологические и биохимические свойства скорость размножения

Высокая ассимиляция целлюлозы Слегка положительная единственный источник.аэота-нитрат калия

Есть рост

Не требуется тиамин среда лакмусового молока

Не кислая

Скорость размножения монокариотического мицелия в 1,5-10 раз больше скорости размножения исходного дикариотического мицелия, высокая скорость размножения имеет важное значение для промиаленного проиэвод" ства.

Этот монокариотический мицелий можно применить для тех же целей, Если нельзя получить до"таточного количества монокариотического мицелия за один опыт выращивания,то обработку ведут после гомогениэации культуры до получения нужного количества монокариотического мицелия, Выращивание ведут при температуре

25 + 5 C в течение -от 3 до 15 дней.

Монокариотический мицелий гриба

Со r i о Ри s че rs i-co i ог (Fr) Quet хранится в Исследовательском институте ферментации, Агенства промышленной науки и техники {Ниба-Ши, Япония) под номером FERM-P Зб86.

Свойства мойокариотического мицелия гриба Go r i o Fus vers 3 co Por (F r)

0ие2 представлены в табл. 1.

Суспендированное состояние

Не образуется

Более короткий и толще, чем дикариотичвский мицелий

1 что и дикариотический мицелий

Сог! оРив versi со Рог (Fr) Quaff. Например, можно получать азотсодержащие полисахариды путем его экстракции водной средой, например водой, разбавленным щелочным раствором или разбавленным кислотным раствором, такое аэотсодержащее полисахаридное веце65 ство можно применять для получения

991954 лекарств, например, противоопухолевых препаратов, активирующих иммунитет препаратов; противовирусных лекарств, противогрибковых препаратов,. противопрокаэиых лекарств, усилива- ющих аппетит препаратов.

Можно также получить различныв виды энзимов, например протвазу, аьялазу путем низкотемпературной экстракции. Кроме того., сам мицелий или его, экстракты или остатки можно применять в пище и напитках на корм скоту и удобрениях для растений.

П р и и в р 1. Получение монокариотичвского мицелия.

100 мп жидкой. среды, содержащей

5В глюкозы и 0,75% дрожжевого экстракта пипеткой загружают в коническую колбу на 500 мл и после паровой стерилизации в течение 20 мин при 120 C в автоклаве, среду инокулиру- 2Q ют 1 мл суспензия мицелия, полученного диспергированием мицелия

Соr Iolaus vers i cotor (Fr) Que х, . полученного иэ 20-дневной. стационарной культуры, выращенной при 25 С с использованием жидкой среды, содержащей. ЗЪ глюкозы и 0,5% дрожжевого экстракта в 60 мл физиологического солевого раствора путем дробления мицелиального мата мешалкой при ско- р рости ее 6000 об/мин в течение

3 мин, затем начинают выращивание нри встряхивании при скорости мешалки

200 об/мин при 25 С . Через 3 дня пос.ле начала культивации выращенный материал переносят в асептических усло-.

5 виях в смеситель на 200 мл и после измельчения вещества гомомиксером при скорости 10.000 об/мин в течение

10 мин возобновляют сразу выращивание при встряхивании и продолжаюг в течение 7 дней. Полученный таким способом мицелий не имеет сцепляющихся соединений и плохо дает воздушный мицелий в стандартной среде иэ агара.

Результаты микроскопического исследо- Q5 вания после окраски, приведенные ниже, показали, что весь полученный мицелий-является монокариотическим.

1 мл бульона, содержащего мицелий, полученный как укаэанв выше, добавля- 50 ют к 10 мл воды, затем ведут центрифугнрование при 2000-5000ОС в течение 5 мнн. Верхний слой жидкости удаляют н мицелий переносят в пробирку, в которую добавляют фиксирующую жидкость Хелли. После выдержки в течение

24 ч отделенные. клетки проьывают

10 мл воды до их обесцвечнвания. Затем клетки помещают в 10 мл 3 Н соляной кислоты и нагревают при бООС в течение 15 мнн, затем охлаждают до комнатной температуры, проьивают

10 мл воды, затем на 2 мин погружают в 10 мл разбавленной в 20-50 раз азотной кислоты и 2-3 раза прожвают по 10 мл воды. 65

Полученные волокнистые клетки раскладывают на. стеклянной пластине для испарения влаги, затем на волокна наносят несколько капель раствора Гимса, и после 15-минутного выстаиванкя, нх,промывают слегка водой, затем сушат .

Прн изучении окрашенных таким образом ядер клетки под микроскопом с увеличением 1000,-раз, каждое ядро видно в виде красной круглой точки. IIoэтому можно легко определить число ядер подсчетом круглых окрашенных в красный цвет точек в одной клетке мицелия. Полученный мицелий не подкисляет лакмусовое молоко и не разжижает желатин.

Размножение монокариотического мицелия ее

Монокариотический мнцелий, полученный описанным вьаае способом, добавляют в 12 л жидкой среды, содержащей 5% глюкозы и 0,75% дрожжевого экстракта, и -загружают в чашечный ферментатор на 20 л, затем прямо в ферментатор подают водяной пар под давлением 2 кг/см . После паровой стерилизации при 120 С в течение ,20 мин и охлаждения, 1 л суспензии, содержащей монокарнотнческнй мицелий, -инокулируют (со скоростью 0,5 г/л) сразу вслед за этим ведут культивирование при скорости аэрировання .0,5 объем. объем/мин и скорости перемвшивания 550 об/мнн. Для сравнения ведут культивирование дикариотнческохо мицелия полностью прн таких же условиях как и для монокариотического мицелия. При сравнении скорости размножения этих .моно- и дикарнотического мицелия, по времени, требующемся для достижения концентрации мицелия 8 г/л быпо установлено, что монокариотический мицелий требует всего 1/4 часть времени культивирования по сравнению со временем для культивирования дикариотического мицелия. Было также подтверждено, что выход монокариоти ческого мицелия выше на 20В по сравнению с дикариотнческим мнцелием.

Пример 2. Производят под счет числа ядер по методике из примера. 1 в мицелии, полученном из культуры скошенного агара Corlofus vers3соРог (Fr) QueP. В результате было установлено, что все эти клетки были дикариотические, монокариотическив не были обнаружены.

100 мл жидкой среды, содержащей

5% глюкозы и 0,75% дрожжевого экстракта, помещают в коническую колбу на 500 мп,и стерилизуют ее там при нагревании. Затем эту среду ннокулируют дикариотичеаким мицелием с помощью платиновой петли, затем ведут выращивание при встряхивании в течение 3 дней (предварительное выращивание) при температуре 25 + -2 С. 7аким образом, получают мнцелнй в форме

991954 пластинок. Бульон, содержащий этот пластннчатый мицелий, -гомогенизируютгомосмесителем в течение 5 мин, затем обрабатывают на срезывание,при этом пластинчатая форма почти исчезла. Культивирование ведут при выше; укаэанных условиях и через 4 дня (основное культивирование) полученный пластинчатый мицелий снова гомогени« зируют в течение 5 мин и снова обрабатывают срезом. Концентрация клеток грибка на этой стадии составляет 11 r/ë.

1 мл бульона, содержащего гомогениэированный мицелий, добавляют в ту же жидкую среду, которую применяют в первом опыте культивирования, затем ведут второй опыт культивирования при таких же условиях как и в первом опыте. Период культивирования несколько изменяют, предварительное культивирование ведут в течение

3 дней, а время основного сокращает до 3 дней. Концентрация грибковых клеток почти такая же, как и в первом опыте выращивания при встряхивании.

Третий опыт выращивания продолжают таким же образом, причем концентрация грибковых клеток достигает почти такого же уровня, как в первом опыте выращивания при встряхивании в течение 2 дней предварительного культивирования и 3 дней основного культивирования.

Аналогично ведут четвертый опыт культивирования и получают бульон с концентрацией грибковых клеток

12 г/л, выше чем в первом опытв,но о при двухдневном предварительном- культивировании и при двухдневном основном культивировании. Полученный мицелий не имеет формы пластинок и находится диспергированным в виде пульпы и не требует гомогенизационной обработки.

Как установлено микроскопом грибковая клетка не имеет сцепляющих соединений, которые имеются в обычном дикариотическом мицелии, она почти вдвое шире по сравнению с дикариотическим мицелием.

При определении числа ядер по описанному в примере 1 способу, было подтверждено, что эти клетки полностью представляют собой монокариотический мицелий.

При дальнейшем размножении мицелия при таких же условиях, как в предыдущем опыте, размноженный мицвлий состоит из монокариотического мицвлия и обладает всеми свойствами монокариотического мицелия, показанным в табл. 1.

Также установлено, что скорость размножения монокариотического мицелия более чем s два раза превосходит скорость размножения дикариотического мицелия.

10 r высушенного продукта монокариотического мицелия, полученного ,по примеру 1, экстрагируют 300 мп горячей воды при 95-10.0 С в течение

3 ч. Зкстрактный раствор концентрируют при йониженном давлении при

30 С, затем к нему добавляют чистый этанол с концентрацией 90% образовав1ц шийся осадок оушат и получают 0,2 г eporo порошка.

Химический анализ этого серого порошка подтверждает, что это вещество представляет собой азотсодержащий

15 высокомолекулярный полисахарид. При введении этого вещества ьишам с трансплантированной опухолью саркомы -189 твердого типа, оно показывает высокую противоопухолевую актив2О ностье

ЗО

Ю

П р и.м е р 3. 100 мп жидкой среды, содержащей 5% глюкозы и 0,75% дрожжевого экстракта, помещают в коническую колбу на 500 мп, в которой уже находилось 8 г стеклянных шариков диаметром 2-5 мм, эту смешанную среду после тепловой стерилизации заражают дикариотическим мицелием

Cor i o7us vers | coPor (Fr) Quet, таким же как применяли в примере 1, с помощью платиновой петли, затем ведут выращивание при встряхивании в течение 7 дней ёри 25 + 2 С.

1 мп бульона, содержащего полученный таким образом мицелий, добавляют в среду, содержащую стеклянные бусы и ведут выращивание при встряхивании в течение б дней. Полученный прбдукт дальше подвергают третьему опыту выращивания при встряхивании в %ечение 5 дней. Полученный при этом продукт мицелий не имеет скрепляющих соединений, он в 1,5 раза шире, чем дикариотический мицелий, подсчет ядер по способу из примера

1 показал, что это монокариотический мицелий.

1 мп этого бульона инокулируют в 100 мл жидкой среды, содержащей

5Ъ глюкозы и 0,75% дрожжевого экстракта, и не содержащей стеклянных . бус,*и культивируют при 25 + 4 С.Концентрация мицелия через 3 дня после начала культивирования составляет

10,5 г/л, в то время как результат подобного выращивания дикариотического мицелия привел через 4 дня после начала культивирования к концентрации всего 7 г/л.

Пример 4. 100 мп жидкой среды, содержащей 58 глюкозы и 0,75% дрожжевого экстракта, загружают в коническую колбу на 500 мп эту среду после тепловой стерилизации инокулируют дикариотическим мицелием

991954

Cor1otus vers! cofor. (Fr) Quet из примера 1 с помощью платиновой петли, затем ведут выращивание при встряхиваний в течение 3 дней. После гомоге- . низации содержимое ферментатора накрывают полиэтиленовым мешком и герке5 тизируют от воздуха,- затем культивируют в течение 4 дней. По окончании культивирования в атмосфере ферментатора содержится 5,0%

1 мп бульона, содержащего полученный таким образом мицелий, инокулируют в среду по способу иэ первого опыта, затем ведут второй .опыт выращивания при встряхивании, .-. как в первом опыте. Такое культиви-. рование повторяют еще два раза. 3 .результате определений проведенных

«ак в примере 1, установлено, что весь полученный по этому способу мнцелий представляет собой моиокарио- 20 тический мицелий.

Пример 5. Иицелий, полученный из скошенной агаровой культуры

Cor1ogus versicofor (Fr) чцеГ отбирают для пробы и определяют качество 25 ядер по методике, описанной в примере 1, при этом установлено, что весь мицелий представляют собой дикариотический мицелий, отсутствует монокариотический мицелий. Это показыва- 30 ет, что полученный в этом опыте мицелнй-является дикариотическим ми-целием.

100 мп.жидкой среди, содержащей

5% глюкозы и 0,75% дрожжевого экст- З5 ракта, помещают в коническую колбу на 500 мл после тепловой стерилизации, затем инокулируют мицелием

Coriofus versicolor (Fr} Quet СИ-103 с помощью платиновой петли, затем ведут выращивание при встряхивании при 25 + 2 С в течение 7 дней. Иицелий этой культуры оказывается дикариотическим, концентрация составляет 10,8 г/л.

Полученный таким образом дикариотический мицелий инокулируют в количестве 0,01% 20 л жидкой среды, в которой растворено 10% глюкозы и

1,5Ъ дрожжевого экстракта, и ведут ,погружное выращивание.при перемешивании в ферментаторе при 25 + 2 С с помощью лопастной мешалки при скорости 500.об/мин. После выращивания в течение 7 дней концентрация мицелия в,бульоне составляет 10,2 г/л.

20 мл этого бульона вносят в такув же среду, второй опыт культивирования ведут при таких же условиях s течение б дней. Такое же культивиро- бО ванне еще повторяют в течение 5 дней ! в третьем опыте и в течение 4 дней в четвертом опыте. По окончании четвертого опыта культивирования бульон находится в виде равномерной пульпы, концентрация мнцелия в нем составляет 11,5 г/л;

Иицелий не содержит сцепляющих соединений и весь представляет собой монокариотический мнцелий.

Пример б ° Инокулируют в каждые 100 мл стерилизованной жидкой среды, содержащей ингредиенты, соот» ветственно показанные в табл. 2 и сохраняемые каждая в 500. wt конической колбе, по 1 м водной суспензии мицелия, приготовленного диспергированием мицелия Cor i o Eus vers i со For (Fr) Quet, полученного при культивировании грибов в жидкой питательной среде, содержащий 3 вес.В глюкозы и

0,5 вес.Ъ экстракта дрожжей, при

25 С в течение 20 дней, разбавлении полученной таким образом культивированной культуры гриба б/5-кратным обьемом водного физиологического солевого раствора и измельчении смеси в смесителе в течение 3 мнн при скорости б00 об/мин для получения гомогенизированной дисперсии мицелия Iðèбов, в. которой -не замечено мицелия в форме шариков и инокулированную питательнув среду культивируют при встряхивании при 25оС при перемешивании со скоростью 200 об/мин в течение 3 дней. Затем полученную таким образом культивированную среду эсептически переносят в смеситель емкостью 200 мя и подвергают измельчению при скорости 10000 об/мин в тече ние 10 мин. Измельченную таким образом питател нув среду снова пускавт на культивирование при 25 С в соото ветствующих атмосферных условиях.

В этих опытах погружного культивирования при встряхивании было отмечено, что образование монокариотического мицелия протекает более интен-, сивно в случаях, когда аэральная фаза фефментера (в этих случаях кол-. бы) содержит другое количество кислорода, чем азота по сравнению со случаями, когда атмосфера не содержит количество кислорода, другого, чем количество азота, или в случае, когда атмосфера содержит-слишком большое количество кислорода по сравнению с азотом. Концентрация 520 об.Ф, предпочтительно 5-15 об.Ф, является подходящей для этой цели.

Условия..погружного культивирования при;встряхивании Сог оРцв чвгsicotor (Fr) Que1 представлены в табл. 2.

991954

Таблица 2

0,75

100

0,75

0,75

10

0,75

0,75

20

1,5

100

1,5

1,5

10

1,5

10

1,5

20

7,5

1,0

100 (2

7,5

1,0

95 (3

7,5

1,0

10

7,5

1,0

15

7,5

1,0

20

Формула изобретения

ВНИИПИ Заказ 174/78 Тираж 521 Подписное

Филиал ППП "ПатЕнт",г.ужгород,ул.Проектная,4

Предложенный способ позволяет получить монокариотический .мицелий гриба Cor io fus vers i ño for (Гг) Quei который может найти широкое применение в медицине и пищевой промышленности.

1. Способ получения монокариотического мицелия гриба Coriofus чегs leo for (Fr) Que9, заключающийся в том, что дикариотический мицелий гриба измельчают в жидкой среде, затем измельченный мицелий вносят в жидкую питательную среду, содержащую 5"

10% глюкозы и 0,75-1,5В экстракта дрожжей,. культивируют в аэробных условиях лри концентрации кислорода

45 5-20 об.Ъ и температуре 25+ 5 С до образования монокариотического мицелия, далее полученную культуральную жидкость гомогениэируют и культивируют в.тех же условиях до обраэова о ния гомогенной пульпы.

2. Способ по п. 1, о т л и ч а юшийся тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта," часть гомогениэированной культуральной среды, полученной от предыдущей культивации, многократно пересевают в свежую питательную среду и культивируют в тех же условиях.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. 3 . Nature, 244, 9 5414, 1973, р.р. 304-305.