Способ получения полиэлектролитных комплексов

Способ получения полиэлектролитных комплексов

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

Союз Советских

Социалистических

Республик

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

pic,992523 (61) Дополнительное к авт. сеид-ву — ° (22) Заявлено 270281 (21) 3254917/23-05

Ф с присоединением заявки Нов

Р М g+ з

C 08 F 226/06

A 61 К 39/04

Государственный комитет

СССР по делам изобретений . н открытий (23) Приоритет

Опубликовано 30.0133. Бюллетень N9 4 (33) УДЫ(678.746.. 5-9 (088. 8 ) Дата опубликования описания 300183

В.A. Кабанов, M.И. Мустафаев, В.В. Нико

Л.Ш. Норимов, Р.В. Петров и P.M. Xau (72) Авторы изобретения (71) Заявитель

Ф ь, ю. (54 ) СПОСОБ ПОЛУП;НИН ПОЛИЭЛВКТРОЛИТНЬ К

КОМПЛЕКСОВ

Изобретение относится к синтезу биолог.ически активных соединений, кон; кретно к способу получения полиэлектролитных комплексов очищенного белкового деривата туберкулина (ОБДТ ) с кватернизованными поли-4-винилпиридинами (ПЭ ), обладающих стимулирующим действием на иммунную систему б 10

Указанное свойство соединений позволяет применить их в биологии и в медицине, конкретно в иммунологии.

Известно, что ПЭ являются мощными иммуностимуляторами, обладающими неспецифическим активирующим действием на иммунную систему и способны образовывать устойчивые полиэлектролитные комплексы с бнополимерами (1).

Наиболее близким к предлагаемому является способ получения полиэлектролитных комплексов взаимодействием слабого иммуногена — бычьего сывороточI ,ного альбумина (SCA ) с кватернизован:ным поливинилпиридином 21.

Иммунизация: полученными устойчивыми при физиологических значениях рН и ионной силы комплексами вызывает иммунный ответ с накоплением BCA-: специфических антителобразующих клеток. (AOK ), число которых значитель.49 но превьыает количество АОК, накапливающихся при раздельном введении животным БСА и указанных ПЭ. В аналогичных условиях чистый HCA сам по себе не индуцирует антителообразования. Однако комплексы SCA-ПЭ не Могут найти широкого применения, так как получение высоких титров антител против SCA не является актуальным для современной иммунологии.

Цель изобретения — получение высо. коиммуногенных соединений, обладающих туберкулин-специфической активностью.

Поставленная цель достигается тем, что,согласно способу получения полизлектролитных комплексов взаимодействием иммуногена с кватернизованными поли-4-винилпиридинами в качестве иммуногена используют очищенный белковый дериват туберкулина.

Сущность предлагаемого способа заключается в комплексообразовании между ПЭ и биополимерами и во взаимодействии ОБДТ и ПЭ в слабощелочных буферных растворах с рН 7-11 и ионной силой от 0,05 М до 0,2 M при 4-50 С соотношении компонентов о

1 5.

992523

55

Формула изобретения

Необходимые для проведения реакции концентрации ОБДТ и ПЭ выбирают исходя из дозы ОБДТ, необходимой для иммунизации данного вида лабора° торных животных, и из требования, чтобы в системе не присутствовали свободные, не связанные в поликомплекс компоненты. Последнее достигается изменением исходных соотношений компонентов в смеси с последующим анализом растворов методами скоростной седиментации и гель-хроматографии. При весовом соотношении компонентов в поликомплексе, равном 1:5 (0,134 г/дл ОБДТ и 0,69, г/дл ПЭ ), в системе отсутствуют свободные компоненты.

Реакцию проводят при смешении равных объемов растворов ОБДТ и ПЭ, доведенных до рН исходного буфера, Смешение лучше проводить на магнитной мешалке, при умеренном перемешивании, с магнитом, помещенным в подходящую пластиковую оболочку (полиэтилен, тефлон ) в течение 20-30 мин.

Реакцию проводят при температуре от 4 С до 50 C . После ее окончания смесь растворов доводят до выбранного рН, упаривают на роторном испарителе при 25-37 С и лиофильно высушивают. Полученные порошкообразные продукты в дальнейшем используют для физико-химических исследований и имь низации животных. Все растворы для иммунизации готовят на стерилизо. ванной воде.

Пример 1. Комплекс стандарт ного препарата ОБДТ (препарат PPLD — L

Ленинградского Института вакцин и сывороток ) с сополимером 4-винил-йэтил пиридиний и 4-винил-й-цетил пиридиний бромидов(° 100% 90%, п1+ и

М вЂ” средневязкостная мол. мас.

200000 Д ) — ПЭ-1.

Равные объемы (5 мл ) растворов

0,134 г/дл ОБДТ и 0,680 г/дл ПЭ-1 в тетраборатном буфере (pH 9,2 ) смешивают при 20 С при умеренном перемешивании на магнитной мешалке с оправленным в полиэтилен магнитом, в течение 20 мин. Затем доводят рН смеси до 9,2, упаривают на роторном испарителе при 37 С, лиофильно высушивают и используют в дальнейшем для иммунизации.

Пример 2. Комплекс стандарт. ного препарата ОБДТ (PPD-L ) c поли4-винил-й-этилпиридиний бромидом (— ° 100% 90%, М =200000 Д)-ПЭ-2.

m+n Ч . Равные объемы (5 мл ) растворов

0,134 г/дл ОБДТ и 0,680 г/дл ПЭ-2 в тетраборатном буфере рН 9,2 ) смеьявают при 25 С при умеренном перемешивании на магнитной мешалке с оправленным в полиэтилен магнитом в течение 30 мин. Затем доводят рН смеси до 7,2, упаривают на роторном испарителе при 37 С, лиофильно высушивают и используют в дальнейшем.для иммунизации.

Комплексообраэование регистрируют методами турбидиметрического титрования, скоростной се)алиментации и гельхроматографии.

Пример 3. Изучение иммуно10 генности комплекса ОБДТ-ПЭ-1. Полученный комплекс ОБДТ-ПЭ-1 (пример 1 ) по 0,3 мл внутрибрюшинно вводят мышам линий С57В1 и CBA из расчета

450 мкг, связанного в комплекс ОБДТ

f5 на мышь. Через 10 дней мышей забивают и определяют число AOK в селезен. ках мькаей по стандартной методике

Ерне с использованием эритроцитов барана, нагруженных исходным ОБДТ с помощью СгС1 6Н О.

В качестве контроля используют раствор ОБДТ в тетраборатном буфере с рН 9,2, которым по 0,3 мл из расчета 450 мкг на мышь иммунизируют контрольных мышей. Число AOK регистрируют так же, как и для комплекса

ОБДТ-ПЭ-1.

Пример 4. Изучение иммуногенности комплекса ОБДТ-ПЭ-2. Проводят аналогично примеру 3. Данные показывают повышение иммуногенности

ОБДТ, связанного в комплексы с ПЭ, по сравнению с исходным ОБДТ.

При исследовании комплексов ОБДТ как с ПЭ-1, так и с ПЭ-2. обнаружено повышение иммуногенности в 2025 раз, по сравнению с исходным ОБДТ.

Однако иммуногенность комплекса

ОБДТ-ПЭ-1 выше, чем комплекса ОБДТПЭ-2, поэтому его использование для

40 иммунизации животных является наиболее актуальным и позволит проводить работы по изучению роли антител против микробактерий, испольэовать комплекс для аналитических и диагностических целей как в иммунологии, так и в медицине.

Полученные вышеописанным способом высокоиммуногенные комплексы позволят сэкономить большое число лабораторных животных, используемых для получения иммунного ответа к ОБДТ и время, необходимое для получения желаемого титра антител.

Способ получения полиэлектролитных комплексов взаимодействием иммуногена с кватернизоьанными поли-4винилпиридинами, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью получения высо коиммуногенных соединений, обладаюших туберкулин-специфической активностью, в качестве иммуногена ис992523!

Составитель Г. Русских

Редактор A. Власенко Техред T.Иаточка

Корректор О. Билак

Заказ 365/29 Тираж 492

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Подписное

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4 пользуют очищенный белковый дериват туберкулина.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Кабанов В.А. и др. Синтетические полиэлектролиты H регуляция оТдельных этапов иммуногенеза. Итоги йауки и техники, ВИНИТИ AH СССР, "Иммунология", т. 7, 1978, с. 223.

2. Кабанов В.A. и др. Йммуногенность комплекса бычьего сывороточного альбумина с поликатионом, нагруженным гидрофобными боковыми группами, ДАН СССР, т. 243, 1978, с. 1330-1333 (прототип 3.