Питательная среда для выращивания sеrrатiа маrсеsсеns 24- продуцента нуклеазы

Питательная среда для выращивания sеrrатiа маrсеsсеns 24- продуцента нуклеазы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

 

ОП ИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Союз Советскик

Социалистических

Республик iu992568 (SI ) Дополнительное к авт; саид-ву (22) ЗаЯвлено 24.07.83., (21) 3328336/28 13 (51)М. В(л. с присоединением заявки М

{23) Приоритет

С. 12 /Ч 9/22

С 12 Н 1/20

Гесудврстпинек квинтет

СССР оо екви кзебретвккк и юткрытий

Опубликовано 30.01,83. Бюллетень М 4 (53) УДК,577.

:.15(088 8) Дата опубликования описания 30.01.83 (72} Авторы изобретения

Д. В. Юсупова, P. Б. Соколова и 3. А. В

Е

Казанский ордена Ленина и ордена Трудовог

Государственный университет им. В. И. У (7l ) Заявитель (54} ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА. ДЛЯ ВЫРАЩИВАНИЯ

SERRAT IA ИАВСЕЯСЕМ5 2Я- ПРОДУЦЕНТА

НУКЛЕАЗЫ

1

Изобретение относится к ферментной промышленности и касается получения ферментов нуклеаэ, в частности нуклезы

Serra& a mamescens, которая находит применение в научных исследованиях в качестве объекта и инструмента исследо5 ваний, в экспериментальных исследованиях по изучению противоопухолевых- и прогивовирусных свойств нуклеазы, в ватвринарии в качестве лечебного препарата .против вирусных заболеваний насекоыьтх, для получения 5 — деэоксирибомононук1 леотидов и др.

Известна питательная среда для Roлучения ДНКазы ЭеггаИа шагcescens шт 41 (пигментный штамп), содержащая . глюкозу, сернокислый аммоний, двуэамещенный фосфат калия, литий сернокислый, железо сернокислое, хлористый натрий в количестве 2,0, 2,0, 1,0, 0,004, 0,002, 0,002 г и кислотный гидролизат казеина, дрожжевой экстракт в количестве 0,05 л на 1 л среды. ДНКазная активность указанного выше штамма

600 виск. ед. в мл культуральной жидкости 111.

Недостатком среды является низкая активность. кукл еазы.

Известна питательная среда для выращивания Serratia тттагСеьсенэ.— продуцента нуклеаэы, содержащая источники углерода, азота, физиологически активных веществ, а также хлористый натрий, другие минеральные соли и воду, которая в качестве источников углерода, азота и физиологически активных веществ содержит глицерин, нитрат аммония, гидролизат казвина и дрожжевой экстракт при соотношении компонентов, r/ë воды: . Глицерин 5,0

Битрат аммония 5,0

Двузамещенный фосфат. калия 10,0

Сернокислый магний 0,5

Сернокислое железо 0,05

Хлористый натрий 0,5

2568 4

Через 12 ч выращивания на качалке (200 об/мин) при 28 С содержимое, колб переносят в ферментер F EM — 30 с 18 л среды. Процесс культивирования

$ осуществляют 36 ч при аэрации л воздуха/л среды {минимум 1:1).

Нуклеазную активность определяют ! высокозиметрическим методом в модификации Бенинга и по продуктам гидролиза вискополимерной ЛНК, растворимым в 2%-ной НС О: и определяемым по поглощенито при 260 нм. Реакционная смесь объемом l мл содержит: 1 мг

ДНК, 0,07 М грис-НСР буфера (рН 8,5), 0,007 М SO и O,l мл культуральной жидкости. За единицу активности принимают количество фермента, которое дает увеличение поглощения при 260 нм в опытных образцах по сравнению с контрольными (реакционная смесь без фермента) на L оптическую единицу за час инв- кубации при 37оС в пересчете на мл культуральной жидкости (pygmy ед/мл/ч).

В качестве субстрата используют препаpar высокополимерной Е1НК, выделенной из тимуса теленка.

Активность нуклеазы в культуральной жидкости достигает 160-180 тысяч виск. ед. на 1 мл или 40-50 мкМ рас«

30 щепленной AHK на мл/мин. Культуральную жидкость насыщают сульфатом аммония до 20%, вьптавший при 4 С осадок вмесо те с бактериальными клетками отделяют центрифугированием и отбрасывают, надосадочную жидкость повторно насыщают сульфатом аммония до .90%, оставляют при 4о С на 10 18 ч. Затем осадок огделяют при 6000 д на рефрижераторной

l центрифуге, растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды, подвер40 гают диализу и очистке на ЙЭАЭ-целлюлозе и фосфоцеллюлозе.

Сравнительное изучение продукции нуклеазы штаммом 24 5еггаОы тттыт.—

Cescens на предлагаемой и известной средах показывает, что на предлагаемой среде активность нуклеазы выше в 2 раза в расчете íà L мл культуральной жидкости (табл. 1). ! Т аблица

l0,0

20,0

Питат

Cpf

Извес тная 25000

27000

4700

8,0

Известная. 80000

90000

21,0-25,0

3 99

Гидролизат казеина 1,0 ,Ирожжевой экстракт 3,0

А@уивность нуклеазы.в культуттальной жидкости равняется 50-60 тысяч виск. ед. или 7,5 мкМ расщепленного субстрата—

; ДНК в мин/мл Г 2 3, Недостатком данной питательной среды также является относительно низкая активность нуклеазы в культуральной жидкос ти.

Бель изобретения — увеличение нуклеазной активности продуцента -5еггс Иы тпагсевсепв 24.

Поставленная цель достигается тем, . что питательная среда для выращивания

9er rat u mar ce scans 24 — продуцента нуклеазы, содержащая источники углеро- да, азота, физиологически активных веществ, а также хлористый натрий и дистиллированную воду, в качес.тве источников углерода, азота и физиологически активных веществ содержит галактозу; о сяную муку и бактериологический пептон при следующем соотношении компонентов, г/л воды:

Овсяная мука 2,0 8,0

Галак гоза 2,5-10,0

Хпористый натрий 2,5-7,5

Бактериологический пеп тон 5,0 15,0

Пример. Культуру Serrat4a

tnarcescenS 24 выращивают в течение суток в пробирках со скошенной средой, содержащей, г/л воды:

Овсяная мука . 4,0

Галактоза 5,0

Хлористый натрий 5,0

Бак териологический .пелтон

Агар-агар

Йистиллированная вода Остальное . pH равняется 7,6.

11осевной материал смывают 0,5% физиологическим раствором и засевают в две колбы, содержащие.по 200 мл жидкой среды того же состава (исключая агар),из расчета l мл инокулята на

100 мл сроды.

13000 15200 i 70 75

992568

Продолжение табл. 1 зы в мкМ/

Предлагаемая 1 60000 180000

МПБ 2000022000

26000 31000

70 75

40,0 50,0

3800

7,0

Ф

В табл, 2 приведены значения огно- симости от.соотношения компонентов сительной активности нуклеазы в зави- 15 среды.

Табnèöа 2

Компоненты

Концентрация, г/л Н О.8,O

Овсяная мука

Г алак тоза

2,0

4,0

10,0

5,0

2,5.

5,0.

2,,5

5,0

7,5

15,0

Пелтон

10,.0

ДНКазная активность, в % от оптимальной

10-25 100 80-90

Формула изобретения

ИНИИПИ Заказ 37 1/31 Тираж 521 Подписное, Филиал ППП "Патент, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 йальнейшее понижение концентрации компонентов среды приводит к еще боль- рр шему снижению активности нуклеазы, а увеличение концентрации компонентов среды нецелесообразно с экономической точки зрения.

Фермент легко осаждается из среды сульфатом аммония при 90% насыщении, выход фермента .при осаждении сульфатом аммония 70-75%,т. е. не ниже чем в ранее рекомендованных средах.

Среда апробирована в полупроизводст-, > венных условиях на базе лаборатории микро биологии ВНИИ ПБ НПО Биохимреактяв .

Стоимость сульфат-аммонийной фракции фермента с активностью .1000 единиц на рекомендуемой среде, включая затраты на основные материалы, тран-. спортно-складские расходы, зарплату и т. д., в 1,8 раза ниже по сравнению со стоимостью известной среды. Использование предлагаемой среды приводит к повышению нуклеазной активности штамма

24 на 200% и удешевляет процесс получения сульфат-аммонийной фракции фермента на 45%.

Питательная среда для выращивания

3еггаОа marcescen5 24 - продуцента нуклеазы, содержащая источник углерода, азота, физиологически активных веществ, а также хлорисгый натрий и дистиллированнуюводу,отличающаяся тем, что, с целью увеличения нуклеазной ,активности цродуценга. в качестве источ-. ников углерода, азота и физиологически активных веществ среда содержит галакгозу, овсяную муку и бактериологический пепгон при следующем соотношении компонентов, г/л воды:

Овсяная мука 2,0-8,0

Г алак тоза 2,5 10,0

Хлорисгый натрий 2,57,5

Бактериологический пеп гон 5,0-15-0

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе.

1. Авторское свидетельство СССР

¹ 230052, кл, С 12 и 9/22, 1967.

2. Авторское свидетельство СССР № 340691, кл. С 12 N 1/20, 1970.