Способ получения октапептидов
Патент 993816
Авторы
Способ получения октапептидов
Иллюстрации
Реферат
Oll NCAHNE
И.ЗОЬРЕЕЕ Н ИЯ
< >993816
Союз Соеетскнх
Соцналистичесннх
Реса бабник
К ПАТЕНТУ (61) Дополнительный.к натенту— (Щ Заявлено1.6. 01. 81- (21) 3233003/23-04 (5l ) М. Кл.
С 07 C- 103/52
// А 61 К 37/02 (23).Приоритет . — (32)18. 01. 81
Гесударствшшый кеенетвт
СССР ве деяан кзебретвнвй
H яп рытий (З1) 100/80 (33)ВНР
Опубликовано 30; 01. 83. Бюллетень Эй 4 (53) УДК 547.964. .4. 07(088. 8) Дата опубликования описания 31. 01. 83 (72) Ав1 оры изобретения
Иностранцы
Ольга Ньеки, Лайош Кишфалуди, Эгон Карпати и Ласло Спорни (BHP) (7!) Заявитель
Иностранное предприятие
"Рихтер Гедеон Ведьесети Дьяр (ВЙР) PT" (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ОКТАПЕПТИДОВ
Изобретение относится, к получению октапептидов, обладающих биологической активностью, которые могут найти применение в медицине для диагности-ки и терапии. 5
В пептидной химии широко используется способ получения пептидов путем отщепления защитных групп от соответствующих пептидных производных тиолизом (в случае динитрофенильной защит" о ной группы гистидина) 1.1 1.и каталитическим гидрированием (в случае,:нап= ример, бензилоксикарбонильной группы, нитрогруппы и т.п.) (2 >
Использование известных методов позволяет получить новые соединения, обладающие интересными фармакологическими свойствами.
Цель изобретения " получение новых октапептидов, расширяяхких арсенал эъ средств воздействия на живой орга- . низм.
Поставленная цель достигается тем,. что согласно способу получения октапептидов общей формулы
Х-Arg-Va 6-Ту r-) Eeu-Hi s-P ro-Y-ОА В), где X=Sar;
Y-остаток молочной кислоты, или
L-2-окси-3-метилвалериановой кислоты
А-водород, этил, защищенный октапептид общей формулы
Z-X-Arg(N0 ) -Vaь -Tyr(Bzt) -1leu-His(Dnp)-Pro-Y-F p -(i >) где Z - бенэилоксикарбонил;
X u Y имеют i. указанные значения;
Bzl - бензил;
Dnp - динитрофенил;
F - этил, бензил, обрабатывают 2-меркаптозтанолом для отщепления динитрофенильной защитной группы гистидина, а затем остальные защитные группы отщепляют каталитическим гидрированием., Синтез исходных защищенных октапептидов осуществляют ступенчатым наращиванием пептидной цепи с использованием пентафторфениловых эфиров соответствующих й- трет.бутилоксикарбониламинокислот.
99381
В приведенных примерах использованы следующие сокращения:
Lac - L-молочная кислота;
HHV - L-2-окси-3-метилвалериановая кислота; $
PfP " пентафторфенил;
Вос - трет.бутилоксикарбонил;
BzC - бензил;
Z " бензилоксикарбонил;
Dnp - динитрофенил. 10
При тонкослойной хроматографии используют ппастинки с силикагелем ("Иерк") и следующие сме=и растворителей:
1 гексан:этилацетат 4:1, 15
2 этилацетат:пиридин:уксусная кислота:вода = 20:6:11/95:5, I
3 этилацетат:пиридин:уксусная кислота:вода = 20:6:11/90:10, 4 этилацетат:пиридин:уксусная кис- 20 лота: вода = 20:6:11/80:20, 5 этилацетат:пиридин:уксусная кислота:вода = 20:6:11/70:30
6 н-бутанол:уксусная кислота:вода=
=4:1:5 (верхняя фаза) 2S
7 н-оутанол: уксусная кислота: пиридин:вода = 30:6:20:24
8 н-бутанол:этилацетат:уксусная кислота: вода = 1:1:1:1.
Для обнаружения пятен используют з© раствор нингидрина и смесь хлортолидин/йодистый калий.
Очистку конечных октапептидов осуществляют с помощью колоночной хроматографии на колонке, содержащей 0,5 л карбоксиметилцеллюлозы (КИС-52), пред35 варительно уравновешенной 0,01 И раствором уксуснокислотного аммония. Очистку осуществляют в режиме градиентного элюирования с применением
1,5 л 0,01 И и 1,5 л Р,4 М растворов уксуснокислого аммония, которые подают через градиентный смеситель со скоростью 25 мл/ч. Фракции, содержащие чистый конечный продукт, подвергают
4S лиофилизации.
Пример 1. Первая стадия.
Раствор 2,15 г (l0 ммоль) Вос-Рго-ОН в 10 мл безводного тетрагидрофурана охлаждают до О С и прибавляют к нему при перемешивании порциями в течение 10 мин 2,4 г (15 ммоль) карбонилдиимидазола. Затем смесь добавляют порциями в течение 15 мин при
0 С к раствору 1,8 г (10 ммоль) зилового эфира молочной кислоты в
10 мл безводного тетрагидрофурана, перемешивают 30 мин при 00С, 2 ч при
6 4
20 С и выдерживают в течение ночи в холодильнике. Затем отгоняют растворитель, остаток растворяют в 30 мл хлороформа, экстрагируют 1 н. раствором соляной кислоты (4 раза по 10 мл), водой, 10.мл водного раствора кислого углекислого натрия и водой. Органическую фазу сушат над безводным сернокислым натрием и упаривают до постоянного веса. Остаток сушат над Р20 .
Получают 3, 0 r Boc- P ro- Lac-O Bz f (807. от теоретического выхода) В(1=
=0,32; R 2 =0,57.
Вторая стадия. Z-Saг-Агд (NO ) - Ja fл
-Туг(ВкЬ)-! Й-R is(Dnp)-Pro-Lac-OBzf.
2,35 г (7,5 ммоль) Boc-Pro-Lac3%
-OBz6 растворяют в 15 мл 3 н. раствора НС! в диоксане, выдерживают 15 мин, добавляют 30 мл безводного эфира и упаривают досуха ° Полученный в остатке хлоргидрат свободного дипептида
НС8-Н-Pro-Lac-OBz3 В(— — 0,37 растворяют в 20 мл диметилформамида, доводят рН раствора до 8 прибавлением триэтиламина и прибавляют 2,9 г (5 ммоль) Вос-His(Dnp)-OPfp. Смесь перемешивают в течение 1 ч при комнатной температуре и рН 8,0, отгоня-. ют растворитель. Остаток растворяют в этилацетате, экстрагируют !03-ным раствором лимонной кислоты, 1 н. раствором соляной кислоты, 54-ным водным раствором кислого углекислого натрия и водой. Органическую фазу сушат над безводным сернокислым натрием, отгоняют растворитель. Полученный в остатке защищенный трипептид Вос-His(Dnp)-Pro-Lac-OBzE (В =0,77) растворяют в
121
l0 мл 8 н. раствора НСВ в диоксане, через 20 мин прибавляют безводный эфир, выпавший осадок отфильтровывают, промывают эфиром. Полученный хлоргидрат свободного трипептида HCf-H-His(Dnp) -Рro-! ас-OBzg (R(f )=0,10) растворяют в 20 мл диметилформамида, рН раствора прибавлением триэтиламина доводят до 8,0 и добавляют 2,78 г .(7 5 ммоль) Вос-I 4-OPfp. Реакционную смесь перемешивают в .течение 1 ч при рН 8,0, отгоняют растворитель, остаток растворяют в этилацетате, экстрагируют l03-ным раствором лимонной кислоты, 1 н. раствором соляной кислоты, 54-ным раствором кислого углекислого натрия и водой. Затем органическую Фазу сушат над безводным сернокислым натрием и упаривают. Остаток растирают с н-гексаном и от5 9938 фильтровывают. Полученный защищенный тетрапептид Вос-Ife-Нis-(Dnp)-Pro"-Lac-08zg (R < =0,67) растворяют s
10 мл 8 н. раствора НС1 в диоксане, через 15 мин прибавляют безводный 5 эфир и выпавший в осадок хлоргидрат свободного тетрапептида HCl Н-I ge-His{Dnp)-Pro-Lac-OBzВ (й =0,52) отделяют, растворяют .в 20 мл диметилформамида, рН раствора прибавлением триэтиламина доводят до 8,0 и прибавляют 3,24 г (6 ммоль) Boc-Tyr(Bzf)- -0Pfp. Смесь перемешивают, при рН 8,0
30 мин, упаривают, остаток растворя,ют в этилацетате и раствор смешивают са 0,22 мм N,N-диметиламиноэтанола, выдерживают 15 мин. Затем раствор экстрагируют 10, -ным раствором лимс1нной кислоты, l н. раствором соляной кислоты, водой, 5Ж-ным раствором кис- 20 лого углекислого натрия и водой. Органическую фазу сушат над безводным сернокислым натрием и упаривают. Остаток растирают со смесью н-гексан-эфир (8:2) и отфильтровывают. Полу- 2s ченный защищенный пентапептид Вос-Туг(В f)-I Ь-His(Dnp)-Pro-Lac-OBzg (R < -0,72) растворяют в 10 мл 8 н.
5L раствора НС 2 в диоксане, через 15 мин прибавляют безводный эфир и выпавший 30 осадок хлоргидрата свободного пентапептида НС ь-Н-Tyr (Bzf) - I fe-Hi s(Dnp)-.Pro-Lac-0Bzk. растворяют в 20 мл диметилформамида, рН раствора доводят -до
8,0 прибавлением триэтиламина и смешивают с 2;6 г (6,8 ммоль) Вос-Чаf-0Pfp. Смесь -перемешивают 1 ч при рН
8,0 и. упаривают. Остаток растворяют в этилацетате и раствор экстрагируют как описано выше. Органическую фазу сушат над безводным cîðíîêèñëûì натрием и упариеают. Остаток растирают с безводным эфиром и отфильтровывают, Полученный защищенный гексапептид
Вос-Ча3-Tyr(Bzl)-18е-Hi s(Dnp)-Pro(3 I
-Lac-0Bz3 (R <=0,83) растворяют в
10 мл 8 н. раствора HCE в диоксане, через 15 мин прибавляют безводный эфир и выпавший в осадок хлоргидрат свободного гексапептида НС1-Н-VagS0
-Tyr (8z l) -1 fe-Hi s (Dnp) -Pro-Lac-08z l
-(R<< I=0,65) растворяют в 20 мл диметилформамида,. рН раствора доводят до
8,0, прибавлением триэтиламина, и прибавляют 2,2 г (5 ммоль) Вос-Агя(МЯ
-OPfp. Смесь выдерживают 1 ч ()ри рН
8,0, разбавляют 60 мл,хлороформа и экстрагируют 10/-ным раствором лимонной кислоты, 1 н. раствором соляной
16 4 кислоты и водой. Органическую фазу сушат над безводным сернокислым натрием и упаривают. Остаток растирают со смесью этанола и эфира (1:!) -и про" дукт отфкльтровыеают. Полученный за", щищенный гептапептид Вос-Arq(N04)-Ча 3-Ту r (Bz 3) -1 ье-Н i s (Dnp) -Р ro Lac"
-08zt (R < =0,65) растворяют в 10 мл
8 н. раствора HC) в диоксане, через
15,мин прибавляют безводный эфир и выпавший е осадок хлоргидрат свободного гептапептида HC 6 Н-Arg (NO ) -Ча f-Ту 1 (Bz()-1 (е-kl s(Dnp).-pro-Lac-OBZI. (R < =0,40) отфильтровывают, промывают (5 эфиром и сушат. Затем полученный продукт растворяют в 15 мл диметилформамида, рН раствора прибавлением триэтиламина доводят до 8,0 и добавляют
1,8 г (5 ммоль) Z-Sar-OPfp. Смесь пе". ремешивают 30 мин при рН=8,0, разбав- . ляют 60 мл хлороформа и экстрагируют водой. Органическую фазу сушат над безводным сульфатом натрия и упаривают. Остаток р)встирают безводным эфиром и продукт отфильтровывают.
В итоге получают 2,12. г (29,63 от теоретического выхода, рассчитанного на гистидин) Z-Sar-А g(NOy)-Va(-Tyr(Bz 3) - I е-Н i s (Dnp) -Pro-Lac-OBzf T. пл.
204-213оС; ((з)=0 465)
Третья стадия. Н-Sar-Arg-Vaf-Tyr-I fe-Нis-Pro-Lac-OÍ. йО
1,45, г (.1 ммоль) Z-Sar-Arg-Ча1-Туг(Bzf)-IРе-His(Dnp)-Pro-Lac-0BzE растворяют в 5 мл диметилформамида и смешивают с 2,3 мл (30 ммоль) 2-меркаптоэтанола. Смесь перемешйвают 1 ч прибавляют безводный- эфир, выпавший осадок растворяют в метаноле и вновь осаждают, прибавляя эфир. В итоге получают 1,14 г.(894 от теоретического выхода) Z-Sar-Arg(NO )-Vaf-Tyr(BzC)-Ife-Нis-Pro-1ас-08z7 (R =0,60); (Ф1
Полученный продукт растворяют е
40 мл смеси метанола, уксусной кислоты и воды (5: 1:2). Раствор смешивают с 0,6 r 103-ного палладиевого катализатора на активированном угле, после чего через реакционную смесь при интенсивном перемешивании пропускают s течение 0 ч газообразный водород;
Затем катализатор отделяют фильтрованием, промывают смесью метанол-уксусная кислота-вода (5: 1: 1) и объединенный Фильтрат упаривают. Остаток растирают с безводным этанолом и продукт отфильтровывают.
Получают 0,7 г (84 от теоретического выхода) Н-Sa r-Arg-Ча 0-Tyr- I Te7 9938
-Н i s-P ro" Lac-OÍ, который подвергают очистке по описанной. выше общей мето; дике. В итоге получают целевой продукт, имеющий следующие характеристи- . ки: Rg =0,17; R =0,40; Р =0,21.
Аминокислотный анализ: Pro 1,0 (1);
Vaf 1,0 (1); 1fe 1,03 (I); Tyr 0,85 (1); His 0,85 (I); Arg 0,96 (I); Sar
0 (i). (Ы3 а= -101,3 (С="0,25; 1 н. уксусная кислота). 10
Пример 2. Sar-Arg-Vag-Tyr-1 fе"Hi s-Pro-Lac-ОИ
Первая стадия.
4,3 г (20 ммоль) Вос-Pro-ОН растворяют в 20 мл безводного тетрагидрофу- ts рана, раствор рхааждают до О С и в течение 10 мин к нему прибавляют порциями 4,8 r (30 ммоль) карбонилимидаэола. Затем при 0 С по каплям прибавляют охлажденный до 0 С раствор 2,1 r 20 (20 ммоль) этилового эфира молочной кислоты в тетрагидрофуране. Реакционную смесь перемешивают 30 мин при О С, о
2 ч при 20 С и оставляют на ночь. Затем тетрагидрофуран удаляют отгонкой. 2s
Остаток растворяют в 40 мл этилацетата и раствор экстрагируют 1 н. раствором соляной кислоты (2 раза по 15 мл),, водой, 53-ным раствором кислого углекислого натрия (2 раза по 20 мл) и водой. Органическую фазу сушат над безводным сернокислым натрием и упаривают. Остаток сушат в эксикаторе до постоянного веса.
В итоге получают 2,.22 r (36 от теоретического выхода) Вос-Pro-Lac"OEt R =0,77; Rg =0,36.
Вторая стадия Z-Sar-Агя(МО2)-Va&
-Tyr(Bz))-I 4-His(Dnp)-Pro-Lac-OEt
1,8 г (6 ммоль) Вос-Pro-Lac-OEt раст.- 4 воряют в 8 мл 7,5 н. 1 зствора HCC в диоксане, через 15 мин прибавляют
30 мл эфира и упаривают. Полученный
Ф в остатке НС1 ° Н-Pro-Lac-OEt (R<"1=0,31) растворяют в 15 мл диметилформамида, рН раствора прибавлением триэтиламина доводят до 8,0, и добавляют 2,9 г (5 ммоль) Вос-Нis(Dnp)-OPfp. Смесь выдерживают 1 ч, упаривают и остаток растворяют в этилацетате. Полученный раствор экстрагируют 10 -ным раство50 ром лимонной кислоты, 1 н. раствором соляной кислоты, 59, -ным раствором кислого углекислого натрия и водой.
Органическую фазу сушат над безводным сульфатом натрия и упаривают. По55 лученный,в остатке защищенный трипептид Вос-HI s(Dnp) -Pro-Lac OEt (R
Г
=0,69) растворяют в 20 мл 7,5 н. раст.
16 8 вора НСВ в диоксане, через 20 мин прибавляют безводный эфир и выпавший в осадок хлоргидрат свободного трипептида HC5 H-His(Dnp)-Pro-Lac-OEt (R =
=O,18) растворяют в 15 мл диметилформамида, рН раствора доводят до 8,0 прибавлением триэтиламина и добавляют 3,0 г (7,5 ммоль) Вос-!fe-OPfp.
Смесь выдерживают при рН=8,0 30 мин, упаривают и остаток растворяют в этилацетате. Полученный раствор экстрагируют как описано выше. Органическую фазу сушат над безводным сульфатом натрия и упаривают. Остаток растирают со смесью эфир-н-гексан (2:8) и продукт отфильтровывают. Полученный защищенный тетрапептид Вос-I е-Н1s (Dnp).-P ro-Lac-ОЕ t (RI -— О, 36) растворяют в 10 мл 8 н. раствора НС1 в диоксане, через 15 мин прибавляют безводный эфир и выпавший в осадок хлоргидрат свободного тетрапептида НС1iН-1fe-Н1s(Dnp)-Pro-Lac-OEt (дЯ=0,27)
Е растворяют в 20 мл диметилформамида, рН раствора доводят до 8,0 прибавлением триэтиламина и добавляют 3,24 г (7 ммоль) Вос-Tyr (Bz f) -OPf p. Смесь выдерживают 30 мин при рН= 8,0 и упаривают. Остаток растворяют в этилацетате и раствор смешивают с 0,22 мл
М,й-диметиламиноэтиламина. Через 40 мин раствор экстрагируют как описано выше. Органическую фазу сушат над безводным сульфатом натрия и упаривают.
Остаток растирают с н-гексаном и продукт отфильтровывают. Полученный защищенный пентапептид Boc-Tyr(BzE)-11е-Hi s(Dnp)-Pro-Lac-ÎEt (R(> — — 0,64) растворяют в 10 мл 8 н. раствора НС1 в диоксане, через 15 мин прибавляют безводный эфир и выпавший в осадок хлоргидрат свободного пентапептида
HCf Н-Tyr(Bzf) -1 fe-Н1s(Dnp) -Рго-Lac-OEt (К14 =0,33) растворяют в 15 мл, диметилформамида, рН раствора доводят до 8,0 прибавлением триэтиламина и смешивают с 2,1 г (5,5 ммоль) Boc-Va1-OPfp. Смесь выдерживают 30 мин при рН=8,0, упаривают и остаток растворяют в этилацетате. Полученный раствор экстрагируют как описано выше. Органическую фазу сушат над безводным сульфатом натрия и упаривают. Остаток растирают с н-гексаном и продукт отфильтровывают. Полученный защищенный гексапептид Вос-Vaf-Tyr(Bz g)-I Ее -Н1s(Dnp) -P ro-Lac-OE t (R(<1=0, 76) растворяют в 10 мл 8 н. раствора HC I в диоксане, через 15 мин прибарляют
6 10 катализатора на активированном угле и при интенсивном перемешивании через раствор пропускают в течение 20 ч газообразный. водород. Затем катализатор отфильтровывают, промывают смесью метанол-уксусная кислота-вода (5:1:1} и объединенный фильтрат упаривают. Остаток растирают со смесью этанол-эфир и продукт отфильтровывают.
В итоге получают 0,72 r (96 от теоретического выхода) Н-Sar-Arg-Ча Т-Туr-!Те-His-Pro-Lac-OEt, который подвергают очистке по описанной выше общей методике. В итоге получают це= левой продукт, имеющий следующие характеристики: Кф =0,24; Р{« I=0,53;
R =0,36. Аминокислотный анализ: Pro
1,02 (I); Val 0,97 (!); 1 ье l,08 (I);
Туг 0,9! (I); His 1,00 (I); Arg 1,07 (I), S„1,0 (I).Pgg2II= -73,5o (С=
=0,4; 1 н. уксусная кислота).
Пример 3. Sar-Arg-Vag-Tyr-IPe-His-Pro-HMV-OH.
Первая стадия. H-HMV-OBzg.
7,12 г (40 ммоль) Н-НМЧ-Ойа суспендируют в 10 мл этилацетата и сус- . пензию смешивают с 20 мл 4 н. раство ра HCf в этилацетате. Смесь перемешивают 2 ч, затем доводят рН смеси до
7 прибавлением триэтиламина, выпавший осадок отфильтровывают, промывают этилацетатом (2 раза по 20 мл). Значение рН объединенного фильтрата доводят до 6,0 прибавлением триэтиламина и добавляют 8 мл (60 ммоль) бензилбромида и 8,4 мл (60 ммоль) триэтиламина. Смесь кипятят 8 ч, образовав-шийся осадок отфильтровывают и фильтрат экстрагируют водой, 1 н. раствором соляной кислоты, 5ф-ным раствором кислого углекислого натрия и водой. Органическую фазу сушат над безводным сульфатом натрия и упаривают.
В итоге получают 5 6 г (633 от теоретического выхода) Н-НИ\(-QBzg, который очищают перегонкой в вакууме. Т. кип.
184- 186 С/5 мм рт. ст.; с )2 = - l3,9
-(C=l; ацетон).
Вторая стадия. Вос- Pro-HMY-OBzi.
2,7 r (!2,5 ммоль) Вос-Pro-ОН растворяют в I5 мл безводного тетрагидрофурана, раствор охлаждают до ООС и прибавляют к нему небольшими порциями в течение 10 мин 3,2 г (20 ммоль) карбонилдиимидазола. Смесь- смешивают при О С с раствором 2,8 г (12,5 ммоль)
Н-НМ7-OBz1 в 10 мл тетрагидрофурана, перемешивают 30 мин при 0 С, 2 ч при
9 9938 I безводный эфир и выпавший в осадок хлоргидрат свободного гексапептида
HC1 Н-Va f-Tyr(Bz E)" I Pe-Hi s (Dnp) -Pro-Lac-OEt (R < I=0,34) растворяют в
20 мл диметилформамида, рН- раствора доводят до 8,0, прибавлением триэтиламина и смешивают с 3,96 г (6 ммоль)
Вос-Arg(N02)-ОР1р. Смесь выдерживают при рН 8,0 1 ч разбавляют 60 мл хлороформа и экстрагируют как описано выше. Органическую фазу сушат над сульфатом натрия и упаривают. Остаток растирают с безводным этиловым спиртом и продукт отфильтровывают.
Полученный защищенный гептапептид
Вос-Arg (N02) -Vaf;Tyr(8zE) -1 е-Hi s (Dnp)-Pro-Lac-OEt (R =0,78) растворяют в 10 мл 8 н. раствора НС1 в диоксане, через 15 мин прибавляют безводный эфир, выпавший в осадок хлоргидрат свободного гептапептида рас
НСТ Н-Аrg(N02}-Ча0-Туr(-ВгE)- I Ре-Н i s (Dnp)-Pro-Lac-OEt fR < 0,56) растворяют в 20 мл диметилформамида, рН раствора доводят до 8,0 прибавлением триэтиламина и смешивают с 2, I2 г (5, 5 ммоль) Z- Sar-OP f p; Смесь выде р= живают 30 мин при рН 8,0 и разбавляют 60 мл хлороформа. Полученный раствор экстрагируют как описано выше. 30
Органическую фазу сушат над безводным сульфатом натрия и упаривают. Остаток растирают с эфиром, продукт отфильтровывают и перекристаллизовывают из этанола.,35
В итоге получают 1,21 г (17, 53 от теоретического выхода, рассчитанного на .гистидин) Z-Sa r-Arg (МО2) -Ча Ь-Tyr (Bz E) - I e-Hi s (Dnp) -Pro-Lac-OEt. T. пл.
208-212 С; В 1=0,5.
Третья стадия. Н-Sar-Аг9-Чаg-Tyr"
-I fe-His-Pro-1ас-0Et.
1,21 r (0,88 ммоль) Z-Sar-Arg(802)Ä-Vaf-Ту r- I Q-Hi s (Dnp}-Р ro-Lac-ОЕй растворяют в 5 мл диметилформамида и полученный раствор смешивают с 3 мл
2-меркаптоэтанола. Смесь перемешивают
1 ч, прибавляют безводный -эфир, выгавший осадок отфильтровывают, промывают эфиром, растворяют в метаноле и вновь осаждают, прибавляя эфир.
В итоге получают 0,94 г (893 от теоретического выхода) Z-Sar-Arg(NO2)-Va3- Tyr (8z f) - I 1е-H i s-Pro- Lac-OE t (R =0 59).
И олученный продукт растворяют в смеси, содержащей метанол, уксусную кислоту и воду (5:1:1). Раствор смешивают с 0,5 г IO, — íîãî палладиевого
11 99381
20оС и оставляют на ночь в холодильнике. Затем тетрагидрофуран отгоняют, остаток растворяют в 40 мл этилацетата. Полученный раствор экстрагируют н. раствором соляной кислоты (2 ра- s за по 15 мл ), водой, 53-ным раствором кислого углекислого натрия и водой. Органическую фазу сушат над без водным сульфатом натрия и упаривают.
Остаток сушат при 25 С до постоянно- 10
ro веса.
В итоге получают 3,19 г (653 от теоретичечкого выхода) Вос-pro-HNY-
" у =0р90э R g =0 р33.
Третья стадия. 2-Sar-Arg(NOg) -Va-fTy (Bz б - i ga-Hi s (Dnp) -P ro-HNY-08z i
2 52 г (6 ммоль) Вос-Pro-HMY-OBz? растворяют в 8 мл 8 н, раствора НС1 в диоксане, через l5 мин прибавляют
30 мл безводного эфира и упаривают.
Полученный в остатке хлоргидрат сво.бодного дипептида НС1 H-Pro-HMV-OBzi (R(4 )=0,30) растворяют в 15 мл диметилфориаиида, рН раствора доводят до .ВВ
8,0 прибавлением триэтиламина и прибавляют 2,9 г (5 ммоль) Вос-His(.Dnp)-OPfp. Смесь выдерживают 1 ч при рН
8,0, упаривают и остаток растворяют в этилацетате. Полученный раствор экстрагируют l н. раствором соляной кислоты, водой, 5i-ным раствором кислого углекислого натрия. Органическую фазу сушат над безводным сернокислым натрием и упаривают. Полученный в остатке защищенный трипептидВос-His(Dnp)-Pro-HMV-OBzl (R =0,67) растворяют в 10 мл 8 н. раствора НС1 в диоксане, через 20 мин прибавляют безводный эфир, выпавший в осадок хлоргидрат свободного трипептида
НС1т Н-His(Dnp)Pro-HMV (R(F440,18) растворяют в 15 мл диметилформамида, доводят рН раствора до 8,0 прибавлением триэтиламина и смешивают с 2,4 r (6 ммаль) Вос-11!е- OPfp. Смесь выдер45 живают 1 ч при рН=8,0 и упаривают.
Остаток растворяют в хлороформе и раствор экстрагируют водой, 1 н. раствором соляной кислоты и 5Ф-ным .раствором кислого углекислого натрия. Орга- 5О ническую фазу сушат над безводным сернокислым натрием и упаривают. Остаток растирают с н-гексаном, гексан отделяют декантацией, а остаток растирают с эфиром и продукт отфильтровыва55 ют. Полученный защищенный тетрапептид - Вос- I Pe-Hi s(Dnp) -Pro-НИМ-OBz f (R 1=0,65) растворяют в 10 мл 8 н.
6 12 раствора НСВ в диоксане, через 15 мин прибавляют безводный эфир, выпавший в осадок хлоргидрат свободного тетрапептида - НС1тН- i ge-Н 1s(Dnp)-Pro-НМУ-ОВг 1 (R < =0,27) растворяют в 15 мл диметилформамида, доводят рН раствора до. 8,0 прибавлением триэтиламина и смешивают с 2,,96 г Boc-Tyr(Bzf)-OPfp. Смесь выдерживают 30 мин при рН 8,0 и упаривают. Остаток растворяют в этилацетате. К полученному раствору прибавляют 0,22 мл N,N-диметиламиноэтиламина, выдерживают 10 мин и экстрагируют 10 -ным водным раствором лимонной кислоты, 1 н. раствором соляной кислоты, 5i-ным раствором киСлого углекислого натрия и водой.
Органическую фазу сушат над безводным сернокислым натрием и упаривают.
Остаток растирают с н-гексаном и продукт отфильтровывают. Полученный защищенный пентапептид Вос-Tyr Bzf)"-! fe-His(Dnp)-Pro-HMV-OBzE (R у =0,75) растворяют в 10 мл 8 н. раствора HCI в диоксане, через. 15 мин прибавляют безводный эфир, выпавший в осадок хлоргидрат свободного пентапептида
НС 1 Н- Tyr Bz f) -1 fe-Hi s (Dnp) -Pro-HMV-082 (R(4 =0,60) растворяют в 20 мл диметилформамида, рН раствора доводят до 8,0 прибавлением .триэтиламина и смешивают с 2,6 г (6 ммоль) Вос-Ча!-OPfp. Смесь выдерживают 1 ч при рН
8,0 и упаривают. Остаток растворяет в хлороформе и раствор экстрагируют
103-ным раствором лимонной кислоты, 1 н. раствором соляной кислоты, Я-ным раствором кислого углекислого натрия и водой. Органическую фазу сушат над безводным сернокислым натрием и vnaривают. Отсаток растирают с н-гексаном и продукт отфильтровывают. Полученный защищенный гексапептид Boc-Va б- Tyr (Bz В) - i Ke-H i s (Dnp) -Р ro-НИЧ-OBzl (R
8 н. раствора НСI в диоксане, через
15 мин прибавляют безводный эфир, выпавший в осадок хлоргидрат свободного гексапептида НСС Н-Чаь-Tyr(Bzf)- i fe-Hi s(Dnp) -P ro-HH -OBzf (R(4>=0,34)
Х растворяют в 20 мл диметилформамида, рН раствора доводят до 8,0 прибавлением триэтиламина и смешивают с 2,64 г (6 ммоль) Bос-Аrg{М02)-.OPFp. Смесь выдерживают 1 ч при рН 8,0 и упаривают. Остаток растворяют в хлороформе и раствор экстрагирует IOi-ным водным раствором лимонной кислоты, 1 н. раствором соляной кислоты, 5;-ным водным
Формула изобретения
Источники информации, .принятые во внимание при экспертизе
1. Химия полипептидов. Под ред.
П. Катсояниса, М., "Мир", 1977, с. 380.
2. Шредер Э., Лобке К. Пептиды. Т. 1, М., "Мир", 1967, с. 112.
ВНИИПИ Заказ 521/78 Тираж 416 Подписное
Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4
13 9938 раствором кислого углекислого натрия и водой. Органическую фазу сушат над безводным сернокислым натрием и упаривают. Остаток растирают со смесью эфира и этанола (8:2) и продукт отфильт- s ровывают. Полученный защищенный гептапептид - Boc-Arg(N02)-Vag-Tyr(Bzf)-1 (е-Hi s(Dnp) -Pro-НМЧ-OBzf (R(< «=0,63) растворяют в 10 мл 8 н. раствора НС1 . в,диоксане, через 15 мин прибавляют безводный эфир, выпавший в осадок хлоргидрат свободного гептапептида
HCf" Н-Агд(NO ) -Ча f-Tyr(Bzt)- I (е-Hi s . ,(Опр) -Pro-HMV-OBz5 (R(=0,45) растворяют в 20 мл диметилформамида, рН IS раствора доводят до 8,0 прибавлением триэтиламина и смешивают с 2,3 г (6 ммоль) Z-Sar-OPfp. Смесь выдерживают 30 мин при рН 8,0, разбавляют
60 мл хлороформа и экстрагируют 1 н. раствором соляной кислоты и водои.
Органическую фазу сушат над.безводным сернокислым натрием и упаривают.
Остаток растирают со смесью эфир - этанол (8:2) и продукт отфильтровывают. 25
В итоге получают 2,36 r (304 от теоретического выхода, рассчитанного на гистидин Z RSa r-Arg (ЙО 2) -Va f-Tyr (Bz f) - t (е-Hi s (Dnp)-Pro-HMV-OBz f. Т. пл.
193-202 С; Ris«=0,30; R g=0,86. зе
Четвертая стадия. Н-Sar-Arg-Ча1У
-Tyr- I fe -Н i s-P ro-HMV-OÍ
2,0 г (1,25 ммоль) Z-Sar-Arg(NOg)Най-Tyr(Bz«,)-1Юе-Н«s(Dnp)-Рго-HMY-0Bzg растворяют в 5 мл диметилформ" амида и полученный раствор смешивают с 2,8 мл 2-меркаптоэтанола. Смесь перемешивают 1 ч, прибавляют безводный эфир, выпавший осадок отфильтровывают, промывают эфиром, растворяют в метаноле и вновь осаждают, прибавляя эфир.
В итоге получают 1,44 r (803 от теоретического выхода) 2-Sar-Arg (N02)"
-Va В-Tyr (Bz 3)-1 -Hi s-Pro-НМУ-OBz Й
R(4I0 41
Полученный продукт растворяют в смеси, содержащей метанол, уксусную кислоту и воду (5: 1: 1). Раствор смешивают с 0,7 r 10r,-ного палладиевого катализатора на активированнои угле и при интенсивном перемешивании через реакционную смесь пропускают в тече16 1Ч ние 20 ч газообразный водород. Затем катализатор отфильтровывают, промывают смесью метанол-уксусная кислотавода (5:1:1) и объединенный фильтрат упаривают. Остаток растирают со смесью этанол-эфир (1: 1) и продукт отфильтровывают.
Получают 0,65 г (673 от теоретического выхода) Н- Sa r-А rg-Va1-Ty r-1 fe-H i s-Pro-HMV-ОН, который подвергают очистке по описанной выше общей методике.
В итоге получают целевой продукт, имеющий следующие характеристики
Rl6LL0,26; Rj1$ 0,02; R(8L0,30. АмииоKHcJlo THblH aHan 3: Pl o 1, 06 (t ) 8 Va g
1,03 (1); Ife 1,03 (1); Tyr 0,65 (I);
His 0899 (t); Arg 0895 (I); Sar 180 (1) (g )2О =- 79, 7 о (С=О, 4; 1 н. уксусная кислота) .
Способ получения октапептидов общей формулы
Х-Arg-Va g-Tyr-1 fe-Hi s-Р го- Y-OA, где Х - Sar-, Y - остаток L-молочной кислоты или 1-2-окси-3-метилвалериановой кислоты;
А - водород, этил, отличающийся тем, что защищенный октапептид общей формулй:
2-Х-Arg(N02)"Vaf"Tyr(8zf)- Ite-His(Dnp)-Рго-Y-F, где Z - бензилоксикарбонил;
Х и Y имеют указанные значения; ВгВ - бенэил;
Dnp - динитрофенил;
F - -атил, бензил, обрабатывают 2-меркаптоэтанолом для отщепления динитрофенильной защитной
« группы гистидина, а затем остальные защитные группы отщепляют каталитическим гидрированием.